CD96亲和肽、多肽探针及其应用

本发明属于生物制药，具体涉及cd96亲和肽、多肽探针及其在制药、临床检查等中的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤亦称癌症，其显著特征为体内细胞不受控制地持续分裂、增殖和转移。与传统肿瘤治疗方法相比，肿瘤免疫治疗更加精准、高效、低损伤，近些年来已经成为肺癌、肠癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤重要的治疗手段之一。肿瘤免疫治疗通过激活机体自身的免疫系统，利用机体产生的免疫活性物质和免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除，使得越来越多的肿瘤患者从中获益。

2、免疫检查点(immune checkpoint)在免疫细胞上表达，是机体免疫系统的“调节器”，在正常情况下可以抑制免疫细胞的功能，对于维持机体自身耐受至关重要，并且在免疫系统对病原体感染做出反应时可以保护自身组织免受损害。但是，一些肿瘤可以通过调节免疫检查点，逃脱宿主免疫系统的攻击，形成免疫逃逸。研究表明，免疫检查点抑制剂能通过阻断免疫检查点分子与配体的结合，恢复免疫细胞功能，从而发挥抗肿瘤效应。截止目前，pd-1、pd-l1抗体类免疫检查点抑制剂在临床抗肿瘤治疗中取得了较好的效果，但是，并非所有的肿瘤患者都能从中获益。因此，越来越多的研究者将关注点转移到pd-1、pd-l1之外的免疫检查点抑制剂的开发上。

3、cd96，也称为tactile(t cell activation increased late expression)，是一种i型跨膜糖蛋白，也是免疫球蛋白超家族中的成员。cd96主要表达在自然杀伤细胞和t细胞上，并能与配体pvr(cd155)、cd111结合。在人体中，pvr是cd96的主要配体。肿瘤发生时，肿瘤细胞表面高表达的pvr与cd96结合，抑制免疫细胞活性，促进肿瘤发生发展。而cd96靶向抑制剂能通过亲和cd96，阻断肿瘤微环境中cd96/pvr结合，在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用。

4、目前，靶向cd96的检查点抑制剂主要是glaxosmithkline公司处于一期临床的多斯达利单抗(gsk6097608)。同时，中国专利申请cn114729049a(gsk)也公开了一种cd96结合蛋白，包含6个由具体序列限定的cdr区(cdrh1-3和cdrl1-3)。此外，中国专利cn110914304b(恒瑞医药)保护一种cd96抗体及其医药用途，抗体的重链可变区包含hcdr1-3区，轻链可变区包含lcdr1-3区，抗体序列区别于上述专利。与抗体药物相比，多肽在保持较强特异性的同时，并不引发adcc效应，且具有较强的实体瘤渗透性。所以，开发更安全、更有效的多肽阻断剂在肿瘤免疫治疗中具有较好的应用前景。

技术实现思路

1、本发明主要解决的技术问题是提供一种cd96蛋白亲和肽，可以阻断cd96与其配体pvr之间的相互作用，具有抗肿瘤活性。

2、其次，本发明提供一种基于cd96亲和肽设计的多肽探针。

3、再次，本发明提供一种cd96亲和肽或多肽探针的应用。

4、最后，本发明提供一种用于预防和/或治疗肿瘤、或者自身免疫性疾病的药物，以及一种用于肿瘤诊断、或者示踪成像的试剂。

5、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

6、一种cd96亲和肽，选自以下多肽或其组合：

7、(1)如seq id no：1所示多肽或其截短肽、衍生肽，或修饰形式；

8、(2)如seq id no：2所示多肽或其修饰形式。

9、作为本发明一种优选的实施方案，所述截短肽为：将多肽的n端或c端截去一个或多个氨基酸，得到一系列更短的多肽。

10、作为本发明一种优选的实施方案，所述衍生肽为丙氨酸扫描肽。具体为：将多肽或其截短肽中的任意一个氨基酸替换为丙氨酸，得到一系列单突变肽。

11、作为本发明一种优选的实施方案，所述cd96亲和肽的序列中每个氨基酸的构型独立地选自d构型或l构型。例如，seq id no：1所示多肽(即母体肽tpt16：leu-ser-val-gly-pro-trp-val-leu-pro-val-glu-his)的序列中所有的氨基酸均为d构型或l构型。当限定某个氨基酸为d构型而未指明其他氨基酸的构型时，均默认其他氨基酸为l构型。例如，seq idno：2所示多肽的氨基酸序列为：alad-vald-serd-leud(即改造肽y8ra)，当用小写的单字母代表对应氨基酸的d构型时，上述序列可以缩写为a-v-s-l。

12、作为本发明一种优选的实施方案，所述cd96亲和肽的修饰形式的修饰位点包括但不限于n端修饰、c端修饰、骨架修饰、侧链修饰、氨基酸修饰等。所述修饰形式为人为成药，在保留多肽活性的前提下进行。修饰的目的包括延长半衰期、增加水溶性、降低或者消除毒副作用等。

13、具体的，所述修饰形式包括但不限于以下一个或多个方面：

14、(1)环肽合成：首尾成环，侧链成环(内酯、内酰胺、醚键等)，多重二硫键，单硫醚环化等；

15、(2)同位素标记：13c，15n，18o等同位素标记；

16、(3)聚乙二醇(peg)修饰：peg2、peg4、peg8、peg12、peg24、peg36，peg2000、peg5000、peg3400，peg20k、peg40k等修饰；

17、(4)磷酸化修饰：l构型或d构型氨基酸(如苏氨酸t、丝氨酸s)的磷酸化修饰，单个或多个氨基酸的磷酸化修饰；

18、(5)偶联蛋白或其他载体：

19、a.多肽-蛋白偶联：klh偶联，白蛋白偶联(如牛血清白蛋白bsa、鸡卵清白蛋白ova、鼠血清白蛋白msa、人血清白蛋白hsa)，白蛋白亲和肽偶联，肿瘤归巢肽偶联，穿膜肽偶联、抗体fc片段偶联，类弹性蛋白偶联等；

20、b.多肽-纳米载体偶联；

21、(6)n端或侧链氨基酸的修饰：乙酰化，甲酰化，生物素标记，三氟乙酰化，苯甲酰化，2-氨基苯甲酰化，马来酰亚胺化，氯乙酰化，溴乙酰化，琥珀酰化，棕榈酸化，苹果酸化，脂肪酸化，甲醛化，螯合反应(如hynic、dtpa、dota、nota修饰)，氯代，氟代，溴代，硝基或甲氧基取代，荧光标记(如cy系列、texas系列、alexa系列、罗丹明、bodipy、rox、fam、fitc、mca、tamra、dnp)、pas修饰等；

22、(7)c端修饰：酰胺化，酯化，醛基化，醇基化，琥珀酰化，荧光标记(如cy系列、罗丹明、amc、afc、pna、cmk、fmk)等；

23、(8)烷基化修饰：n-甲基化，侧链甲基化，n-乙基化，n-苯丙基化，n-烯丙基化等；

24、(9)放射性核素修饰：125i、131i、18f、99mtc、68ga、64cu、67ga、90y、111in、177lu、89zr等放射性核素修饰；

25、(10)其他特殊修饰：糖肽，磺化，maps等。

26、作为本发明一种优选的实施方案，所述cd96亲和肽采用化学合成法制备。化学合成法包括固相合成法(如采用fmoc法)、液相合成法、固-液相合成法。合成策略包括c端合成、n端合成、分段合成。合成时若在c端或n端进行常规修饰，则多肽包含修饰基团。

27、一种多肽探针，包含所述cd96亲和肽的序列。

28、作为本发明一种优选的实施方案，所述多肽探针包括但不限于荧光分子影像探针、放射性核素探针等。

29、具体的，所述多肽探针的结构通式如下所示：

30、m-l-r；

31、式中，m为光标记或放射性核素络合基团；

32、l为连接基团；

33、r为所述cd96亲和肽或其二聚体、或多聚体形式。

34、作为本发明一种优选的实施方案，所述光标记包括但不限于红外荧光染料、含有机发色团的化合物、含有机荧光团的化合物、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物、生物发光分子等。

35、作为本发明一种优选的实施方案，所述放射性核素探针为放射性i或f标记cd96亲和肽上的氨基酸。

36、作为本发明一种优选的实施方案，所述放射性核素络合基团包括放射性核素、用于放射性核素标记的双功能螯合剂。所述放射性核素包括但不限于125i、131i、18f、99mtc、68ga、64cu、67ga、90y、111in、177lu、89zr等。所述用于放射性核素标记的双功能螯合剂包括但不限于nota、dota、dtpa、hynic、dfo等。所述放射性核素络合基团还可以包括放射性核素配体。所述放射性核素配体为n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)和三苯基膦三间磺酸钠盐(tppts)。

37、作为本发明一种优选的实施方案，所述l包括但不限于n为0-10的整数。

38、一种cd96亲和肽或多肽探针的应用，包括但不限于以下一个或多个方面：

39、(1)在制备用于预防和/或治疗肿瘤、或者自身免疫性疾病的药物中的应用；

40、(2)在制备用于肿瘤诊断、或者示踪成像的试剂中的应用；

41、(3)在制备用于定性和/或定量检测cd96蛋白表达与否、表达位置、或者表达含量的试剂中的应用；

42、(4)在制备用于检测对cd96蛋白的亲合和/或阻断能力(例如，阻断cd96与pvr之间的结合)的试剂中的应用。

43、作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂包括肿瘤诊断显像剂、肿瘤边界精准定位显像剂、术中影像导航显像剂等。

44、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物包括靶向型基因治疗药物、化疗药物等。所述肿瘤包括但不限于结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、骨癌、头颈部癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病，以及其他高表达cd96的肿瘤。

45、一种用于肿瘤诊断、或者示踪成像的试剂，包含所述cd96亲和肽或多肽探针。

46、一种用于预防和/或治疗肿瘤、或者自身免疫性疾病的药物，包含所述cd96亲和肽或多肽探针。

47、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为靶向型基因治疗药物或化疗药物。其中，所述多肽探针为放射性核素探针，用于制备肿瘤核素靶向治疗药物。

48、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物中cd96亲和肽以游离形式存在，或者以其药学上可接受的盐的形式存在。所述cd96蛋白可以为人cd96蛋白或小鼠cd96蛋白，也可以为其他来源的cd96蛋白。

49、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物中cd96亲和肽的含量为药效量，可以在0.01wt％-99.99wt％范围内取值。

50、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物中除包含cd96亲和肽外，还包含其他协同或者辅助预防和/或治疗肿瘤的药效成分，用于抑制肿瘤生长或者消除肿瘤，通过联合用药实现联合防治。

51、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物还包含药学上可接受的辅料或载体，包括但不限于赋形剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、调节渗透压的盐、缓冲剂等。所述辅料或载体的种类和用量可以根据药物的不同剂型进行选择和调整。

52、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂型为药剂学上可接受的剂型，包括但不限于粉针剂、注射液、片剂、丸剂、胶囊剂、喷雾剂、分散液等。

53、作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂量为药剂学上可接受的剂量。

54、本发明的有益效果：

55、本发明以cd96蛋白为靶分子，通过噬菌体展示十二肽库高通量筛选技术筛选得到cd96亲和肽(如seq id no.1所示)，并经过后期截短改造得到改造肽y8ra(如seq id no.2所示)。通过体外细胞水平实验和小鼠荷瘤实验表明，cd96母体肽tpt16和改造肽y8ra可以亲和cd96蛋白，阻断cd96与其配体pvr之间的相互作用，从而发挥抗肿瘤功效。

56、本发明提供的cd96亲和肽具有抑瘤效果，且无明显毒副作用，可用于制备以cd96为靶点的抗肿瘤药物(包括预防和/或治疗肿瘤、或者自身免疫性疾病的药物)，为肿瘤免疫治疗提供了一种新的选择。同时，本发明提供的cd96亲和肽在肿瘤诊断或示踪成像方面也具有较好的应用前景，可用于制备以cd96为靶点的肿瘤诊断、或者示踪成像的试剂，具有潜在的临床应用价值。