一种可检测乏氧水平的双光子荧光探针及其原位成像肿瘤组织应用

本发明涉及荧光化学传感器，具体而言涉及一种用于检测乏氧水平的双光子荧光探针及其制备方法、应用。

背景技术：

1、乏氧是由于组织内氧分压降低而引起的病理状态，它常见于高度侵袭性的恶性肿瘤。乏氧还在中风、缺血、炎症性疾病等多种疾病中发挥着重要作用。同样，许多研究组报道，组织供血减少导致乏氧进入组织水平。乏氧还与代谢对抗癌药物抗治疗的不良作用有关，是某些类型癌症的一个指标。在肿瘤疾病的研究中，还观察到乏氧水平与肿瘤区域细胞生长呈正相关。因此，有必要检测细胞和肿瘤中的乏氧水平，这对于检查肿瘤的状态和设想抗癌药物的能力变得越来越重要。

2、目前，已有几种方法用于检测组织中的乏氧水平，例如：电化学法、免疫组织化学技术、核磁共振(mri)分子显像技术、pet分子显像技术等，但这些技术均存在损伤性或费用昂贵等问题。而基于生物标记物的荧光检测方法因其灵敏度高、特异性好、操作简便和背景干扰低等优势而受到越来越多的关注。

3、在乏氧条件下，硝基还原酶(nitroreductase,ntr)、醌还原酶和偶氮还原酶等几种还原酶过度表达。作为最具代表性的低氧酶之一，ntr作为参与低氧张力转录反应的指示性生物标志物，与实体瘤乏氧程度直接相关而备受关注。因此，可通过ntr水平的检测以评价生物系统的乏氧程度。

4、ntr传感器即是利用硝基还原酶在nadh/nadph等电子供体存在下将硝基还原为氨基这一特定策略，被设计用于监测肿瘤中的乏氧水平。nadh是一种被还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是一种已知的还原剂，在生物系统中可以作为电子供体，为生物过程提供电子。目前，已经开发了几种用于ntr的荧光、生物发光和化学发光传感器。在已报道的各种ntr检测方法中，基于荧光的检测方法因其灵敏度高、操作简单、响应速度快、可用于活细胞的高通量筛选而具有重要意义。

5、基于小分子荧光探针的细胞内生物过程成像由于其高灵敏度、大时空分辨率等优势，越来越受到人们的重视，成为成像的有力工具。然而，目前已知的可特异性检测乏氧水平的荧光探针数量较少，且大多数都是单光子(one-photon,op)激发或激发波长和发射波长较短(＜500nm)，容易导致生物组织的光损伤，并且生物体自身荧光会对分析结果产生很大的背景干扰，影响检测精确度。特别是单光子成像由于激发波长较短，难以实现高分辨、高深度的组织成像检测。

6、双光子(two-photon,tp)成像技术是一种连续双光子吸收及长波长荧光发射的非线性光学成像技术，激发和发射波长可以更长，因此具有更深的组织穿透能力、更小的光损伤和光漂白、更高的分辨率等优点，已成为活性蛋白酶检测及活体组织成像的重要工具之一。但目前基于双光子荧光探针检测ntr的技术还存在响应时间长(>100min)、检测灵敏度低(>2μg/ml)、穿透深度小且无法应用到活体组织中测试等问题。

7、因此，亟需开发新的双光子荧光探针实现对ntr快速、灵敏、高效地监测，并最终应用到活体组织中乏氧水平的成像，这对肿瘤诊断、肿瘤治疗和新药开发具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种可检测乏氧水平的双光子荧光探针及其制备方法，该探针的识别基团可以快速插入到ntr活性空腔内，具有响应迅速、灵敏度高、选择性好、生物安全性好、可活体组织成像等特点。

2、根据本发明目的的第一方面，提供一种可检测乏氧水平的双光子荧光探针，该荧光探针包括2-二甲氨基-7-羟基萘双光子荧光团构成的核心荧光团，以及磺酸盐基亚甲基构成的探头。

3、作为可选的实施方式，所述荧光探针的结构式如式ⅰ所示：

4、

5、作为可选的实施方式，所述荧光探针的响应时间≤15min。

6、作为可选的实施方式，所述荧光探针的检测下限为0.059μg/ml。

7、根据本发明目的的第二方面，提供一种前述可检测乏氧水平的双光子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

8、通过2-二甲氨基-7-羟基萘和(4-硝基苯基)甲磺酰氯制备7-(二甲基氨基)-3-甲酰基萘-2-基(4-硝基苯基)甲磺酸盐；

9、通过7-(二甲基氨基)-3-甲酰基萘-2-基(4-硝基苯基)甲磺酸盐制备3-(2,2-二氰基乙烯基)-7-(二甲基氨基)萘-2-基(4-硝基苯基)乙磺酸盐，即得到所需荧光探针。

10、作为可选的实施方式，制备7-(二甲基氨基)-3-甲酰基萘-2-基(4-硝基苯基)甲磺酸盐的具体过程如下：

11、在0℃的氮气环境下，向含有2-二甲氨基-7-羟基萘的三乙胺的dmf溶液中滴加(4-硝基苯基)甲磺酰氯，在室温下搅拌得到第一混合溶液；

12、采用dcm对第一混合溶液进行稀释，并用去离子水洗涤，所得的有机相经无水na2so4干燥后真空浓缩，通过硅胶色谱法进行最终纯化，得到黄色固体7-(二甲基氨基)-3-甲酰基萘-2-基(4-硝基苯基)甲磺酸盐。

13、作为可选的实施方式，第一混合溶液中，2-二甲氨基-7-羟基萘和(4-硝基苯基)甲磺酰氯的摩尔比为0.39:(0.54～0.64)，2-二甲氨基-7-羟基萘为0.10～0.16mmo/ml，(4-硝基苯基)甲磺酰氯的浓度为0.14～0.24mmol/ml，三乙胺的dmf溶液的体积百分浓度为0.031～0.043v/v％。

14、作为可选的实施方式，制备3-(2,2-二氰基乙烯基)-7-(二甲基氨基)萘-2-基(4-硝基苯基)乙磺酸盐的具体过程如下：

15、将7-(二甲基氨基)-3-甲酰基萘-2-基(4-硝基苯基)甲磺酸盐和丙二腈加入到乙醇中，再加入哌啶，然后在氩气环境下，0℃下搅拌20min，再在室温下搅拌3h，得到第二混合溶液；

16、采用旋转蒸发除去第二混合溶液的有机溶剂后，用二氯甲烷溶解并用去离子水洗涤两次，收集有机相，将有机相在无水na2so4上干燥，然后真空浓缩，得到红色固体3-(2,2-二氰基乙烯基)-7-(二甲基氨基)萘-2-基(4-硝基苯基)乙磺酸盐。

17、作为可选的实施方式，第二混合溶液中，7-(二甲基氨基)-3-甲酰基萘-2-基(4-硝基苯基)甲磺酸盐和丙二腈的摩尔比为0.19:(0.19～0.38)，哌啶的浓度为0.40～0.55mmol/ml。

18、根据本发明目的的第三方面，提供一种前述可检测乏氧水平的双光子荧光探针在检测肿瘤组织中乏氧水平上的应用。

19、由以上本发明的技术方案可见，本发明提出的用于检测乏氧水平的双光子荧光探针具有：

20、特异性高：本发明的荧光探针只会在ntr与辅酶nadh同时存在时，被辅酶nadh提供电子后激活后，硝基还原成氨基，接着1，6-消除自发释放富含电子的萘酚荧光团，伴随着荧光增加，从而达到高特异性的目的；

21、响应迅速：该本发明的荧光探针在15min内就可以与ntr反应完全，对比报道的探针响应时间(>100min)，可以大大缩短反应时间；

22、灵敏度高：本发明的荧光探针的检测下限达到为0.059μg/ml，极大地提高了检测灵敏度；

23、选择性好：本发明的荧光探针的只有同时加入ntr和辅酶nadh，才会发生明显的荧光增强；

24、生物安全性高：本发明的荧光探针分子对细胞以及生物体具较高的生物安全性；

25、可活体组织成像：本发明的荧光探针可以成功实现区分肿瘤组织内部的ntr和乏氧水平，且在双光子激光照射下，穿透深度可达224μm；

26、时间稳定性高：本发明的荧光探针稳定性好，可长时间成像ntr活性。