过表达细菌素合成调控基因plnC及其重组植物乳植杆菌的构建方法和应用

本发明属于生物工程及微生物发酵，尤其是涉及一种过表达细菌素合成调控基因plnc及其重组植物乳植杆菌的构建方法和应用。

背景技术：

1、细菌素是一类由核糖体合成，具有抑菌活性的蛋白或多肽物质。其中乳酸菌细菌素因其安全特性在食品加工储藏、生物医药领域得到广泛应用。然而采用传统的方法筛选野生菌种生产细菌素，存在细菌素产量低，分离纯化步骤复杂，生产成本高等问题。因此，利用生物信息学工具设计与细菌素合成相关的基因的引物、扩增、克隆和表达细菌素合成基因，建立高稳定的细菌素重组表达体系已成为生产细菌素的新途径。乳酸乳球菌通用表达质粒pmg36e是一个经典的人工构建的组成型表达载体，被广泛用于研究细菌素作用机制，已成为乳酸菌基因工程研究的重要工具之一。

2、植物乳植杆菌素(plantaricin)是植物乳植杆菌(lactiplantibacillusplantarum)产生的一类ⅱa/ⅱb类细菌素，是其主要抑菌物质之一。植物乳植杆菌素受群体感应(quorumsensing，qs)调控，该调控系统由植物乳植杆菌中控制合成植物乳植杆菌素的基因簇(pln)上的调控操纵子控制。植物乳植杆菌素基因簇的全长在18～29kb左右，分为5个操纵子：plnabcd、plnefi、plnjklr、plnghstuvw、plnmnop等。plnabcd编码的是qs的调控系统，该操纵子既能激活自身转录也能激活另外4个操纵子转录。plna编码自诱导肽(aip)，plnb编码组氨酸蛋白激酶，plnc和plnd编码两个高度同源的反应调控蛋白plnc和plnd，调控蛋白plnc能促进目标蛋白的表达，而调控蛋白plnd却阻遏目标蛋白的表达。plnefi和plnjklr分别编码两个双肽细菌素(plnef和plnjk)和各自的细菌素免疫蛋白(plni、plnl和plnr)。plnghstuvw中的plngh编码abc转运蛋白和辅助蛋白，参与细菌素的运输、分泌和加工，可以将带有双甘氨酸前导序列的细菌素分泌到胞外，plnstuvw编码的蛋白属于caax氨基蛋白酶家族；plnmnop编码四种猜想蛋白。因此，探讨pln基因簇在植物乳植杆菌素代谢合成作用调节机制，这对提高植物乳植杆菌产细菌素能力有着重要意义，也为理解植物乳植杆菌素合成机理和提升细菌素应用性提供有力支撑。目前，国内外并没有公开关于过表达细菌素合成调控基因plnc及其重组植物乳植杆菌的构建方法和应用的相关研究报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种促进植物乳植杆菌素合成的过表达细菌素合成调控基因plnc及其重组植物乳植杆菌的构建方法和应用，过表达菌株b1-plnc的plnc基因表达量显著上升了4.5倍以上、plnc蛋白含量显著提高了1.5倍以上。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种过表达细菌素合成调控基因plnc，所述的基因来自于植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)编码反应调控蛋白plnc的基因，其核苷酸序列如序列表中seq id no:1所示。

3、所述的植物乳植杆菌lactiplantibacillus plantarum，于2024年01月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.29542。

4、上述过表达细菌素合成调控基因plnc的重组植物乳植杆菌的构建方法，具体步骤如下：

5、(1)以植物乳植杆菌基因组dna为模板，设计特异性引物并进行pcr扩增；

6、(2)将步骤(1)扩增得到的plnc基因片段纯化后，与经pst i和hindiii双酶切的线性载体pmg36e采用同源重组技术连接，将连接产物转化至trans1-t1感受态细胞中复制，将阳性克隆子经双酶切验证和菌落pcr鉴定，获得pmg36e-plnc重组克隆载体；

7、(3)将pmg36e-plnc重组克隆载体通过电转化方法转入植物乳植杆菌b1感受态细胞中复制，将阳性克隆经菌落pcr鉴定，获得调控基因plnc的重组植物乳植杆菌。

8、进一步，步骤(1)中所述的pcr特异性引物的序列如下：plnc上游扩增引物tcctctagagtcgacctgcaggtgtttccaatttatttattagaagataacg；plnc下游扩增引物：gttttcagactttgcaagcttctatttctttttcaatattttgttaagct。引物斜体处序列为pmg36e上酶切位点两端同源序列，下划线部分为酶切位点。

9、进一步，步骤(1)中所述的pcr扩增程序如下：(1)预变性95℃，3min；(2)变性95℃，15s，退火60℃，15s，延伸72℃，60s，35个循环；(3)彻底延伸72℃，5min；pcr反应体系为：模板dna2μl，2×phanta max master mix 25μl，正向引物2μl，反向引物2μl，用ddh2o补足至50μl。

10、进一步，步骤(2)中所述的plnc基因片段与线性载体pmg36e按照摩尔比3:1进行混合，连接条件为37℃，30min后，置于4℃，10min。

11、进一步，步骤(3)中所述的植物乳植杆菌感受态细胞的制备，具体步骤如下：取2ml活化后的植物乳植杆菌接种于100ml含0.5wt％葡萄糖和0.5wt％甘氨酸的mrs肉汤，扩大培养至指数期，低速离心收集菌体3000rpm，10min，再分别用预冷的无菌水和含有10wt％甘油和10wt％蔗糖的混合液洗涤菌体，最后用菌体等体积的混合液重悬菌体，制备得到植物乳植杆菌的感受态细胞。

12、进一步，步骤(3)中所述的调控基因plnc的重组植物乳植杆菌验证引物的序列为：36e-c-f：gctcgacatactgttcttccc，36e-cr：gcagtcagcctaatactaccc。

13、上述过表达细菌素合成调控基因plnc的重组植物乳植杆菌在制备植物乳植杆菌素合成的促进剂方面的应用。

14、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了过表达细菌素合成调控基因plnc及其重组植物乳植杆菌的构建方法和应用，plnc编码的plnc蛋白能够正向调控ⅱb类细菌素合成相关基因的表达，对促进植物乳植杆菌素的合成具有重要作用。通过克隆植物乳植杆菌(lactiplantibacillusplantarum)的plnc基因片段连接到pmg36e表达载体上，再通过电转化转入产广谱抑菌细菌素的植物乳植杆菌中，通过红霉素抗性筛选并鉴定获得带有目的基因的重组菌，即过表达细菌素合成调控基因(plnc)的重组植物乳植杆菌b1-plnc。过表达菌株b1-plnc的plnc基因表达量显著上升了4.5倍以上、plnc蛋白含量显著提高了1.5倍以上，证明了plnc在基因和蛋白水平上过表达。与野生植物乳植杆菌b1相比，b1-0和b1-plnc细胞长度变短、直径变宽。细菌素的抑菌活性也显著升高，plnc的过表达在不同程度上显著提高了植物乳植杆菌中pln基因簇内不同区域基因片段(plnabcd、plnefi、plnjklr、plnghstuvw、plnmnop)的表达。本发明首次构建了一株能过表达细菌素合成调控基因(plnc)的重组植物乳植杆菌b1-plnc，为植物乳植杆菌素高效生产奠定了基础和技术支持。

15、上述植物乳植杆菌(lactiplantibacillusplantarum)，保藏编号为cgmccno.29542，保藏日期：2024年01月08日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。