水稻HTS6基因调控叶片衰老及高温耐受性的应用

本发明属于植物基因工程，尤其涉及一种通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因及其应用。

背景技术：

1、随着全球人口增加，人类面临的粮食危机日趋严峻。水稻作为世界三大粮食作物之一，近一半的人口以水稻作为主要食物，其产量一直是生产和育种工作中的重要性状。近年来，由于温室气体排放增多，全球极端气候频发，高温天气常有发生。极端高温诱导水稻叶片早衰，光合作用效率降低，籽粒灌浆能力差，是导致水稻减产的主要原因之一。深入解析作物叶片衰老机理，利用分子育种手段增强作物抗早衰能力，对于保障作物的高产、稳产具有重要的理论意义和应用价值。

2、叶片衰老不是一个无序死亡的被动过程，而是一个受遗传信息精细调控的主动过程。转录组、表观遗传组、蛋白组以及代谢组等多组学研究表明植物在衰老过程中受到复杂而精细的遗传调控。叶片衰老受各种复杂外源环境信号、内源植物激素以及叶片年龄等因素的影响和协同调控。在水稻中，叶片衰老相关基因调控的研究主要集中在叶绿素降解、活性氧、no以及激素调控等方向。在叶绿素调控方面，kusaba等发现水稻osrls1、osnyc1、osrls3、oswls5和osypd1等基因通过参与叶绿体发育或叶绿素合成与降解来调节叶片衰老。在活性氧和no调控方面，wang等证明类真核翻译延伸因子α蛋白osspl33参与调控活性氧积累来调节水稻叶片衰老；而he等发现斑点叶基因ospsl50通过调控h2o2的稳态在水稻叶片衰老和热胁迫响应中起双重作用；lin等发现水稻过氧化氢酶oscatc通过影响h2o2含量调节no合成而参与调控叶片衰老。在激素调控方面，zhou等证明了水稻生长素通过调节蔗糖转运蛋白ossweet5来调控叶片衰老；zhang等证明了水稻细胞分裂素氧化酶osckx11通过调控细胞分裂素的动态平衡来调控水稻叶片衰老。尽管水稻叶片衰老的分子机理研究较多，但环境胁迫尤其是高温诱导水稻叶片衰老的信号通路报道不多。

3、温度是影响植物生长发育的重要环境因子，极端温度也是诱导叶片早衰的重要外界条件。水稻最适宜的生长温度为25℃–28℃，在日平均温度大于30℃且日最高温度大于35℃情况下，水稻生长发育受到高温胁迫。水稻受高温胁迫后会引起膜和光合系统损伤、活性氧和激素失衡、碳水化合物代谢紊乱等生理变化，在营养生长期发芽率低、幼苗死亡，在生殖生长期小穗数减少、花粉活力降低、叶片早衰，籽粒灌浆差、垩白度增加，严重降低水稻产量和品质。林鸿宣院士课题组揭示了一个水稻响应热胁迫的g蛋白信号级联反应，调控蜡质合成相关基因oswr2的表达；该课题组还鉴定了第一个潜在的作物高温感受器，发现在一个控制水稻抗热复杂数量性状的基因位点tt3中存在由两个拮抗的基因tt3.1和tt3.2，它们组成的遗传模块调控水稻高温抗性和叶绿体蛋白降解。kim等在气候室和田间均发现水稻高温胁迫容易诱发叶片早衰并缩短籽粒灌浆期，但是工作未涉及相关基因克隆。因此，尽管作物感受高温胁迫的信号转导取得了很大的进展，但是负责调控高温诱导作物叶片早衰的基因和分子机理尚不清楚。

4、在所有的细胞代谢过程中，光合作用被认为是对高温最敏感的一个过程。当环境温度过高时，光合效率下降，同化物合成减少，所以水稻在高温胁迫下产量会显著下降。蔗糖是水稻光合产物运输的主要形式，由光合源组织产生后通过质外体或共质体途径经由韧皮部运输到库组织，这一过程与籽粒灌浆和产量密切相关。质外体途径通过转运蛋白主动运输，蔗糖在转运蛋白sweet协助下跨膜运输到细胞间隙，再由蔗糖转运蛋白sut跨膜转运到筛管-伴胞复合体(se-cc)；共质体途径通过胞间连丝运输,蔗糖从韧皮部薄壁细胞以被动扩散的方式进入se-cc。万建民院士课题组发现生长素能调控蔗糖转运蛋白基因ossut1的表达来影响糖通过质外体途径的源库运输。同时，zhang等发现高温胁迫会诱导胼胝质在水稻叶片和叶鞘细胞的胞间连丝沉积，造成胞间连丝的堵塞从而影响糖通过共质体途径的源库运输，但是高温调控水稻光合产物通过共质体途径运输的关键基因和转运分子机制仍不清楚。

5、糖是光合作用的产物，也是启动和影响叶片衰老进程的关键分子。近年的研究结果表明糖积累和糖饥饿均能诱导叶片早衰。己糖激酶(hxk)在糖酵解中负责催化己糖的不可逆磷酸化，在高等植物中作为糖传感器介导细胞内高浓度糖信号传导。拟南芥athxk1在番茄植株中的过表达会诱发早衰，而athxk1的缺陷突变体gin2则会延迟叶片衰老。植物糖饥饿信号由一个在真核生物中保守的葡萄糖传感器snrk介导，在糖饥饿条件下，snrk通过激活bzip转录因子协调转录网络，促进分解代谢并抑制合成代谢。在拟南芥中，过表达snrk1家族中的kin10可以增强植物耐糖饥饿能力并延缓叶片衰老，而kin10和kin11表达水平较低的植株在开花前发生早衰。除此以外，t6p和tor作为糖的感受器也可能参与叶片衰老。高糖和低糖代谢物传感器的发现表明糖的稳态是调节叶片衰老的关键机制。如前所述，zhou等证明了水稻生长素通过调节蔗糖转运蛋白ossweet5来调控糖的稳态调控叶片衰老，但是糖的稳态诱发水稻叶片衰老的分子机理还有待深入研究。

6、综上所述，在全球变暖的大环境下，高温对水稻的生长、产量和品质造成严重影响。通常来说全球平均气温每升高1℃，水稻减产3.2％，严重威胁世界粮食安全在生产中迫切需要克隆耐高温新基因并培育耐高温新品种以保证粮食安全。

7、目前尚未有能同时调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因被报道。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因oshts6及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了一种通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老，高温耐受性以及水稻结实率控制的基因及其应用。本发明通过60co-γ射线筛选到一株对高温敏感的突变体，通过对其功能研究，证明其是用过调控源库关系来调控水稻叶片衰老以及高温耐受性。

3、本发明是这样实现的，一种通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因，该基因为oshts6，核苷酸序列为seq id no：1。

4、进一步，所述通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因进一步包括与seq id no：1所示dna序列同源性在90％以上的dna序列。

5、进一步，所述通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因进一步包括通过碱基替换、缺失、增添而产生的一个或多个碱基改变的等位基因或基因衍生物。

6、进一步，所述通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因进一步包括：在严格条件下能与seq id no：1所示dna序列杂交的dna分子。

7、本发明另一目的在于通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因编码的蛋白质，所述编码的蛋白质核苷酸序列为seq id no：2。

8、进一步，所述编码的蛋白质氨基酸序列为seq id no：3；

9、所述编码的蛋白质进一步包括与seq id no：3所示氨基酸序列同源性在90％以上的氨基酸序列；

10、所述编码的蛋白质进一步包括在seq id no：3所示氨基酸序列基础上，通过氨基酸替换、缺失、增添而产生的一个或多个氨基酸改变的蛋白质及蛋白质类似物；

11、所述编码的蛋白质进一步包括如seq id no：3所示蛋白质连接其他标签蛋白而形成的融合蛋白。

12、本发明另一目的在于一种应用所述通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因构建的植物遗传转化载体，所述植物遗传转化载体包括上调oshts6的表达载体；所述上调oshts6的表达载体包括重组型启动子或器官特异启动子构建融合表达载体；

13、所述植物遗传转化载体进一步包括：包含有seq id no：1所示dna序列，或与seqid no：1所示dna序列同源性在90％以上的dna序列，或seq id no：1所示核苷酸序列通过碱基替换、缺失、增添而产生的一个或多个碱基改变的等位基因或基因衍生物，或严格条件下能与seq id no：1所示dna序列杂交的dna分子。

14、进一步，所述植物遗传转化载体进一步包括下调oshts6表达载体，通过crispr/cas9技术、t-dna插入技术、ems诱变、rna干扰技术、基因沉默技术下调seq id no：3所示基因表达；

15、所述植物遗传转化载体通过相关蛋白调节剂上调或下调seq id no：3所示蛋白表达量或活性。

16、本发明另一目的在于一种应用所述植物遗传转化载体进行表达的重组菌、植物愈伤组织以及细胞株系。

17、综上，本发明为了解决现有技术存在的技术问题，需要通过对水稻潜在功能基因进行充分挖掘，首先通过60co-γ射线对普通栽培水稻进行辐照诱变，筛选对高温敏感的突变体，对其进行详细的表型考察，农艺性状统计。即，通过60co-γ射线获得的水稻材料，该材料经过2-3代自交纯合后鉴定，最终获得稳定遗传的hts6纯合突变体，对水稻潜在功能基因的挖掘，培育耐高温水稻新品种，保障当今气候不断变暖条件下我国主要粮食作物的产量和品质具有重要意义。

18、本发明构建oshts6 crispr/cas9敲除载体，并通过pcr扩增及测序手段鉴定出多个独立纯合株系，提供了一种特异敲除水稻oshts6基因导致高温敏感，叶片早衰，结实率低，产量，品质下降的突变体。基于oshts6功能缺失导致其产生的不利于生产的生物学功能，可通过基因编辑、rna干扰、t-dna插入、遗传转化及分子辅助育种等手段，改良现有水稻品种，提高水稻产量和耐高温能力，为培育水稻耐高温品质提供理论基础。

19、在本发明中：

20、cprhts6-1和cprhts6-18对应的是基因功能敲除突变体，测序表明其编码的蛋白质提前终止，蛋白无法发挥正常功能。在野生型nip的背景下，hts6基因敲除的突变体表现出高温耐受性下降(实施例4)，与hts6突变体分别在培养箱条件下高温处理以及在不同维度地区(黑龙江哈尔滨和浙江金华)的表型一致，因此可得知hts6基因功能的丧失导致水稻高温耐受性下降。

21、本发明的技术优势为：本发明提供的通过调控源库关系来调控水稻叶片衰老及高温耐受性的基因oshts6及其应用。本发明通过60co-γ射线筛选到一株对高温敏感的突变体(图1)，使用图位克隆技术定位了基因(图2)，随后使用crispr/cas9技术特异敲除了oshts6基因，获得了遗传背景为日本晴的多穗粒水稻株系对定位结果进行验证(图3)，发现其叶片中累积大量淀粉无法运输至穗子中(图4)，且高温能增加其叶片衰老进程(图5和图6)。