一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵为单瓣、重瓣的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵为单瓣、重瓣的分子标记及其应用。

背景技术：

1、莲是中国的十大传统名花之一，具有极高的文化内涵及观赏价值。同时，莲藕是我国重要的蔬菜之一；莲子、花朵及叶片等皆可入药；还可用于生态环境净化与修复；因此，莲亦具有十分重要的经济价值。迄今，莲属植物仅两种：分布于亚洲和澳洲北部的亚洲莲(n.nuciferagaertn.)以及位于北美、中美洲的美洲黄莲(n.lutea willd.)。亚洲莲栽培品种繁多，花色由红到粉红及白色；而美洲黄莲多数仍处于半野生或自然化状态，仅有淡黄花色，品种较少。两者虽然在地理上存在隔离，但相互杂交可育。

2、迄今为止，全球正式文献记载的荷花品种已达2080个(刘丽等，2019，世界荷花品种资源统计及特征分析)。根据花瓣数量多少，这些荷花可简单分为单瓣和重瓣类型。单瓣是指一朵花中没有雄蕊或者雌蕊转化成花瓣形态，其花瓣数量一般为25～30片；反之，除了上述外围正常的花瓣外(25～30片)，若花朵内部一定数量或全部的雄蕊甚至雌蕊转变为了花瓣，则此朵花为重瓣花。根据花瓣数量多少和瓣化程度，重瓣荷花可人为地细分为半重瓣(31～60片)、重瓣(≥61片)、重台型和千瓣类型(如图1所示)。上述各类型荷花占比为单瓣(40.3％)、半重瓣(10.4％)、重瓣(39.8％)、重台(5.8％)和千瓣(0.09％)；未知瓣数占3.6％(刘丽等，2019，世界荷花品种资源统计及特征分析)。

3、现在普遍认为，单瓣类型荷花较为原始，结实能力高，适宜作为培育子莲或藕莲品种的亲本，且其抗性相对强，常应用于广阔水域的景观效果。重瓣荷花较为进化，花期长，观赏性高，更适宜城市绿地、公园或庭院的栽培和造景。因此，在荷花新品种选育过程中，需要针对性地开展单瓣和重瓣类型的育种。然而，栽培实践表明，荷花杂交或自交莲子播种后，仅约1/3当年可开花，进而可明确其为单瓣还是重瓣，剩余2/3需要次年甚至后年才能开花，这大大增加了荷花新优品种的培育成本和周期。因此，如何在早期即莲子催芽时期(幼苗期)快速准确鉴定杂交或自交后代将来开花是单瓣还是重瓣，一直是困扰着荷花生产企业以及科学研究的一个重要难题，现在尚未有相关分子标记的报道与应用。如能开发出在杂交或自交莲子幼苗阶段鉴定植株成苗时花朵单重瓣的分子标记或者方法，用于早期抉择保留单瓣以选育子莲、藕莲，抑或保留重瓣以培育观赏莲，将极大地节约人力、物力和时间等育种成本，提高育种效率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵为单瓣、重瓣的分子标记及其应用，从而解决因缺乏在早期快速准确鉴定亚洲莲杂交或自交后代将来开花是单瓣还是重瓣的技术，而导致荷花新优品种的培育成本和周期过长的问题。

2、为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

3、根据本发明的第一方面，提供一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵为单瓣、重瓣的分子标记h8，所述分子标记h8的核苷酸序列如seq id no.1所示，其包括一个snp位点，即gcatt[c]aatt中的[c]碱基处，若该snp位点的碱基测序结果为c/c或c/t，则该杂交莲子开花时应为单瓣品种；若该snp位点的碱基测序结果为t/t，则该杂交莲子开花时，89.4％概率为重瓣品种。所述分子标记h8的序列具体如下所示：ggccaatgaatgaacagaatccattgtttcaactttcaactgccaaacaaatctgcttatcagcgcattcaattgtacctagaaaataataaatccattcattaatttcagattaagctttgggcattgtcaaattctaatttctaagtaggggttttctgttaatgctttacccaattacccataatccgtctcctgattagtaggctcttggtaaagaaaacaaaacatgtaatttattaccaagtagctaataaataacgactaaatagtgagtttcttaatcttgatatttgtgctagtgaaaatgagtaattaaatccattggttcttttggtggaagtgtgtaactgggactggatc(seq id no.1)。

4、根据本发明提供的分子标记，其包括一个snp位点(即单核苷酸变异位点)，该snp位点位于荷花5号染色体1400097bp处，双向测序下，单瓣荷花在该snp位点为c/c或c/t，重瓣荷花为t/t。本发明通过围绕此snp位点两侧设计上下游引物，对待检测的杂交或自交莲子幼苗提取dna、pcr扩增，将扩增产物直接双向测序。比对其测序结果即可进行单重瓣预测，如果该snp碱基为c/c或c/t，则其开花时100％为单瓣荷花；如果该snp碱基为t/t，则其开花时89.4％概率为重瓣荷花。

5、根据本发明的第二方面，提供一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵为单瓣、重瓣的引物序列，包括：正向引物h8-f和反向引物h8-r，其核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。

6、正向引物h8-f：5'-ggccaatgaatgaacagaatccat-3'(seq id no.2)；

7、反向引物h8-r：5'-gatccagtcccagttacacact-3'(seq id no.3)。

8、根据本发明的第三方面，提供一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵单重瓣的方法，以待测亚洲莲杂交莲子的基因组dna为模板，通过设计特异性引物扩增如seq id no.1所示的分子标记h8并进行测序，在目标dna序列上gcatt[c]aatt中的[c]碱基处，若测序结果为c/c或c/t，则该杂交单株开花时应为单瓣品种；若测序结果为t/t，则该杂交单株开花时，89.4％概率为重瓣品种。

9、优选地，所述特异性引物包括：正向引物h8-f和反向引物h8-r，其核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。

10、优选地，所述方法用于以亚洲莲为亲本的杂交后代或自交后代幼苗的单、重瓣性状的早期鉴定。

11、优选地，所述方法用于在莲子出芽时期或莲藕幼苗期完成早期鉴定，进而根据育种的实际需求进行单瓣或重瓣的取舍。

12、优选地，所述基因组dna提取自荷花的叶片或根。

13、应当理解的是，本发明中基因组dna的提取并不仅限于叶片，也可以提取自幼苗的根部，但是叶片最容易获得，也最容易提取。由于本发明的目的是对早期幼苗进行鉴定其将来开花是单瓣还是重瓣，如果用其它部位则对幼苗的损伤较大，因此最优选为叶片。

14、本发明的关键发明点主要在于，首次开发这样一种能够用于苗期快速鉴定亚洲莲杂交莲子花朵单重瓣的分子标记，在此之前的现有技术从未公开这样一种分子标记。本发明的技术难点在于，发明人需要挑选大量具有代表性的单瓣和重瓣个体以及制备人工杂交f2单重瓣分离群体去构建单重瓣的各自混池，然后通过大量的分子标记筛选才最终确定这样一种可用于苗期快速鉴定亚洲莲杂交后代单瓣或重瓣的snp位点以及其分子标记，由于篇幅有限，关于该探究过程本文不做过多描述。

15、与依据外形进行单瓣和重瓣鉴定的传统技术相比，本发明具有如下优势：

16、1)大幅降低荷花育种的劳动成本：原本需栽培半年或次年开花时才能明确杂交后代是单瓣还是重瓣，利用本发明可在莲子催芽期于1.5天内实现早期鉴定：如筛选观赏性更高的重瓣类型，则可舍弃单瓣个体幼苗；若选育结实率较高的子莲或者肥大的藕莲，则侧重保留单瓣个体幼苗。如此，可极大地节约容器、场地、基质、化肥等生产成本和人工成本：杂交莲子由催芽、幼苗栽培至开花，一个单株费用约56元：场地费用3元/棵+盆器18元+基质水肥药5元+人工30元＝56元。

17、2)鉴定速度快：该方法可在1.5天内鉴定荷花杂交幼苗后期开花为单瓣还是重瓣。当天上午提取样本dna，下午pcr扩增产物，然后送公司测序。次日上午获得目标幼苗的dna序列，即可推断被检测的莲子幼苗将来开单瓣还是重瓣花朵。特殊需求可12小时内鉴定结果：2小时提取dna，2小时pcr、4-8小时测序。

18、3)鉴定费用低：相比一个杂交后代个体的栽培单价56元而言，鉴定费用不高。1个样本的检测费用，若使用ctab等传统dna提取方法，整个流程约21.1元左右；若使用快速dna提取试剂盒法，约需28.1元。28.1元＝快速提取试剂盒提取dna提取(8元)+10μl体系pcr扩增(酶0.1元)+生工生物有限公司双向测序(20元)。分子标记h8引物上、下游分别合成2管(2od)共计50元(会员只需23元)，约可使用1600次(样)，因此，引物合成成本可忽略不计。

19、4)鉴定效率高：在本发明实施例中，利用h8分子标记进行亚洲莲亲本杂交后代幼苗的单、重瓣性状的早期鉴定，单瓣准确率可达100％，重瓣则为89.4％；若杂交亲本不涉及单瓣类型的泰国、越南和印度热带莲——全球热带莲品种仅占1.1％(刘丽等，2019，世界荷花品种资源统计及特征分析)，准确率可达更高。

20、5)鉴定方法简便：植物dna提取和pcr扩增是最常规的分子生物学试验，一般实验室均可操作。

21、综上所述，根据本发明提供的一种苗期快速鉴定亚洲莲杂交后代花朵单重瓣的分子标记及其应用，在以亚洲莲为亲本的杂交后代或自交后代莲子的幼苗阶段，通过特异性引物对其叶片基因组dna进行扩增和测序，根据目标dna序列上特定snp位点的碱基为c/c或c/t，或是t/t，判断这些幼苗在半年后或者次年长成植株开花时为单瓣还是重瓣类型，进而根据具体的育种目标选择性地进行早期单重瓣取舍，可大量节省人力、物力以及财力成本。本发明具有大幅降低荷花育种的劳动成本、鉴定速度快、鉴定费用低、鉴定效率高以及鉴定方法简便的优点，因此，本发明技术在荷花杂交育种产业中具有极大的推广和应用价值。