提高细胞基因组中同源定向修复(HDR)效率的方法与流程

本技术涉及生物，具体地涉及提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法。

背景技术：

1、本领域已经描述了用于基因组序列的dna靶向切割的各种方法。此类靶向切割事件可用于诱导靶向诱变，诱导细胞dna序列的靶向缺失，并促进在预定染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程化切割系统在靶dna序列中诱导双链断裂(dsb)或切口，使得通过错误产生的过程(例如非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr))而对断裂的修复可以导致基因失活或外源目的序列的插入。通过如下方式可以发生切割：通过使用特异性核酸酶例如工程化锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)，使用crispr/cas系统与工程化单一指导rna(sgrna)来指导特异性切割。

2、通过hdr过程在特定靶位置处的基因组修饰的效率在细胞中相对较低。因此，仍然需要提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法。

技术实现思路

1、在某些实施方案中，本发明提供了用于提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法，其包括：(a)向所述细胞中引入：(i)核酸酶；和(ii)供体核酸，其包括有待插入基因组中的修饰序列；并且(b)使所述细胞经受从37℃到更低温度的温度转变；其中所述核酸酶在所述细胞中的切割位点切割基因组，并且所述供体核酸通过提高的hdr率引导用所述修饰序列修复基因组序列。例如，同源定向修复(hdr)率提高了至少1.5倍。任选地，同源定向修复(hdr)率提高了至少2倍。

2、在某些方面，更低温度为28℃-35℃。任选地，更低温度为30℃-33℃。例如，细胞在更低温度下生长至少24小时或至少48小时，例如1天-5天(1天、2天、3天、4天或5天)。任选地，在温度转变后，细胞在37℃下生长。

3、在某些方面，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一个具体实施方案中，细胞是干细胞，例如诱导多能干细胞(ipsc)。在另一个具体实施方案中，细胞是原代细胞。

4、在某些方面，本发明中使用的核酸酶包括所有dna序列特异性核酸内切酶或rna指导的dna核酸内切酶。任选地，核酸酶是选自cas核酸酶或cpf1核酸酶的crispr核酸酶。例如，核酸酶是cas9核酸酶。为了说明，将crispr核酸酶(例如cas9)与dna形式的sgrna(例如编码cas9核酸酶和sgrna的dna)或rna形式的sgrna(例如sgrna/cas9 rnp或sgrna/cas9mrna)一起引入细胞中。任选地，sgrna是合成的并且是经化学修饰的。在某些方面，供体核酸含有对称同源臂。任选地，供体核酸与基因组中的dna链互补，所述dna链被核酸酶切割。

5、在某些方面，本发明中使用的核酸酶是锌指核酸酶(zfn)。在某些其他方面，本发明中使用的核酸酶是tale核酸酶(talen)。

6、在某些实施方案中，本发明提供了通过上述方法产生的分离的细胞。

7、在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含通过上述方法产生的分离的细胞。

8、在某些实施方案中，本发明提供了向有需要的受试者提供目的蛋白质的方法，所述方法包括：(a)根据上述方法将编码目的蛋白质的供体核酸引入细胞中；并且(b)将细胞引入受试者中，使得目的蛋白质在受试者中表达。

9、在某些实施方案中，本发明提供了一种用于提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法，其包括向所述细胞中引入：(i)核酸酶；和(ii)供体核酸，其含有对称同源臂，与基因组中被所述核酸酶切割的dna链互补，并包含有待以远离切割位点大于10个碱基对的距离插入基因组中的修饰序列，其中所述核酸酶在所述细胞中的所述切割位点处切割基因组，并且所述供体核酸通过提高的hdr率引导用所述修饰序列修复基因组序列。例如，同源定向修复(hdr)率提高了至少1.5倍或至少2倍。任选地，此类方法进一步包括使细胞经受从37℃到更低温度(例如，28℃-35℃或在30℃-33℃)的温度转变。例如，细胞在更低温度下生长至少24小时或至少48小时，例如1天-5天(1天、2天、3天、4天或5天)。任选地，在温度转变后，细胞在37℃下生长。在某些方面，细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一个具体实施方案中，细胞是干细胞，例如诱导多能干细胞(ipsc)。在另一个具体实施方案中，细胞是原代细胞。在某些方面，本发明中使用的核酸酶是选自cas核酸酶或cpf1核酸酶的crispr核酸酶。例如，核酸酶是cas9核酸酶。为了说明，将crispr核酸酶(例如cas9)与dna形式的sgrna(例如编码cas9核酸酶和sgrna的dna)或rna形式的sgrna(例如sgrna/cas9 rnp或sgrna/cas9 mrna)一起引入细胞中。在某些方面，本发明中使用的核酸酶是锌指核酸酶(zfn)。在某些其他方面，本发明中使用的核酸酶是tale核酸酶(talen)。

10、具体地，本发明包括但不限于以下各项：

11、1.一种提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法，其包括：

12、(a)向所述细胞中引入：(i)核酸酶；和(ii)供体核酸，其包括有待插入基因组中的修饰序列；并且

13、(b)使所述细胞经受从37℃到更低温度的温度转变；

14、其中所述核酸酶在所述细胞中的切割位点处切割基因组，并且所述供体核酸通过提高的hdr率引导用所述修饰序列修复基因组序列。

15、2.根据项1所述的方法，其中所述更低的温度为28℃-35℃。

16、3.根据项1所述的方法，其中所述更低的温度为30℃-33℃。

17、4.根据项1所述的方法，其中所述细胞在所述更低温度下生长至少24小时。

18、5.根据项1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

19、6.根据项5所述的方法，其中所述细胞选自干细胞、诱导多能干细胞(ipsc)或原代细胞。

20、7.根据项1所述的方法，其中所述核酸酶是选自cas核酸酶或cpf1核酸酶的crispr核酸酶。

21、8.根据项7所述的方法，其中所述核酸酶是cas9核酸酶。

22、9.根据项7所述的方法，其中将所述crispr核酸酶与dna形式或rna形式的sgrna一起引入所述细胞中。

23、10.根据项9所述的方法，其中所述sgrna是合成的并且是经化学修饰的。

24、11.根据项9所述的方法，其中将编码所述cas9核酸酶和sgrna的dna引入所述细胞中。

25、12.根据项9所述的方法，其中将sgrna/cas9 rnp引入所述细胞中。

26、13.根据项9所述的方法，其中将sgrna/cas9 mrna引入所述细胞中。

27、14.根据项1所述的方法，其中所述供体核酸含有对称同源臂，并且与基因组中被所述核酸酶切割的dna链互补。

28、15.根据项1所述的方法，其中同源定向修复(hdr)率提高了至少1.5倍。

29、16.通过项1所述的方法产生的细胞。

30、17.一种药物组合物，其包含项16的细胞。

31、18.一种向有需要的受试者提供目的蛋白质的方法，其包括：

32、(a)根据项1的方法将编码目的蛋白质的供体核酸引入细胞中；并且

33、(b)将所述细胞引入受试者中，使得所述目的蛋白质在所述受试者中表达。

34、19.一种用于提高细胞基因组中同源定向修复(hdr)效率的方法，其包括向所述细胞中引入：(i)核酸酶；和(ii)供体核酸，其含有对称同源臂，与基因组中被所述核酸酶切割的dna链互补，并包含有待以远离切割位点大于10个碱基对的距离插入基因组中的修饰序列，其中所述核酸酶在所述细胞中的所述切割位点处切割基因组，并且所述供体核酸通过提高的hdr率引导用所述修饰序列修复基因组序列。

35、20.根据项19所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述细胞经受从37℃到更低温度的温度转变。