糖基转移酶及其在合成二-O-β-D-葡萄糖甙中的应用

本发明涉及生物催化，具体涉及糖基转移酶及其在合成二-o-β-d-葡萄糖甙中的应用。

背景技术：

1、槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙具有较高的水溶性和生物利用度。它是蔬菜中主要的膳食类黄酮，特别是洋葱(allium cepa)，可以用作膳食补充剂，功能性食品成分，或用于制药和食品工业的有价值的植物化学物质。槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙具有基本的神经保护作用[sarchielli,erica,et al."neuroprotective effects of quercetin 4’-o-β-d-diglucoside on human striatal precursor cells in nutrient deprivation condition.acta histochemica2018,120:122-128.]，另外，槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙具有抗氧化和抗衰老等功能[d,colina-coca c,char cd,cano mp,de ancos b,sánchez-moreno c.hyaluronidase inhibiting activity and radicalscavenging potential of flavonols in processed onion.j agric food chem.2013,61:4862-72.]。但是槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙在水果和蔬菜中的含量很低，例如洋葱中每公斤新鲜重量约200毫克，因此从水果和蔬菜中大量获得该物质需要大面积种植水果和蔬菜，造成土地资源和原料的巨大浪费，且提取的过程中采用的步骤复杂，导致经济效益较低。因此，使用糖基转移酶将底物直接生物转化为槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙是首选方法[tao y,xu j,shao j,hex,cai r,chen k,liy,jia h.three glycosyltransferase mutants in a one-pot multi-enzyme system with enhanced efficiency for biosynthesis of quercetin-3,4'-o-diglucoside.j agric food chem.2023,71:6662-6672.]。

2、udpg-糖基转移酶一步催化底物的糖基化反应可生成二-o-β-d-葡萄糖甙，具有步骤简单、经济高效等优势[brazier-hicks melissa,offen wendy,gershater markus,revett timothy,lim eng-kiat,bowles dianna,davies gldeon,edwards robert.characterization and engineering of the bifunctional n-ando-glucosyltransferase involved in xenobiotic metabolismin plants.pnas2007,104:20238-20243]。尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose，简称udpg)是葡萄糖的活化形式，可以作为糖基化酶促反应体系中的糖基供体，通过底物的亲核攻击，形成糖苷键[takeshi hiromoto,eijiro honjo,naonobunoda,taro tamada,kohei kazuma,masahiko suzuki,michael blaber,ryota kuroki.structural basis for acceptor-substrate recognition of udp-glucose:anthocyanidin 3-o-glucosyltransferase from clitoria ternatea.protein science,2015,24:395-407.]。

3、到目前为止，有报道称来自a.cepa的糖基转移酶ugt73g1能够催化槲皮素或者槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖甙生成槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙。但是槲皮素和槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖甙作为底物时，产物槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙的转化率只能达到10％和50％左右[kramer cm,prata rt,willits mg,de luca v,steffens jc,graser g.cloning and regiospecificity studies of two flavonoid glucosyltransferases from allium cepa.phytochemistry.2003,64:1069-1076.]。鉴于此，本发明提供一种糖基转移酶以及在合成二-o-β-d-葡萄糖甙中的应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供糖基转移酶及其在合成二-o-β-d-葡萄糖甙中的应用。目的是提供一种糖基转移酶，实现高效率地制备槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面，糖基转移酶，所述糖基转移酶的氨基酸序列如seq id no.2所示：

4、meesktphvaiipspgmghliplvefakrlvhlhgltvtfviagegppskaq

5、rtvldslpssissvflppvdltdlssstriesrisltvtrsnpelrkvfdsfve

6、ggrlptalvvdlfgtdafdvavefhvppyifypttanvlsfflhlpkldet

7、vscefrelteplmlpgcvpvagkdfldpaqdrkddaykwllhntkryke

8、aegilvntffelepnaikalqepgldkppvypvgplvnigkqeakqteese

9、clkwldnqplgsvlyvsfgsggtltceqlnelalgladseqrflwvirsp

10、sgianssyfdshsqtdpltflppgflertkkrgfvipfwapqaqvlahpstg

11、gflthcgwnstlesvvsgipliawplyaeqkmnavllsediraalrprag

12、ddglvrreevarvvkglmegeegkgvrnkmkelkeaacrvlkddgtstkalslvalkwkahkkeleqngnh。

13、本发明的有益效果是：本发明利用糖基转移酶(atogt)作为酶催化剂，并且根据糖基转移酶的功能，推测糖基转移酶能够对槲皮素-4'-o-β-d-葡萄糖甙3位羟基进行糖基化，建立了槲皮素-4'-o-β-d-葡萄糖甙3位羟基糖基化反应，实现天然产物槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙的酶促合成。

14、第二方面，糖基转移酶的编码基因，所述糖基转移酶的编码基因编码所述的糖基转移酶。

15、进一步，所述糖基转移酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示：

16、atggaagaaagcaaaacgccgcatgttgcgattattccgagcccgggt

17、atgggtcatctgattccgctggttgaatttgcaaaacgtctggttcatc

18、tgcatggtctgacggttacgtttgtgattgcaggtgaaggtcctccga

19、gtaaagcacagcgcacagttctggattcactgccgtcatctattagcag

20、cgttttcctgccgccggttgatctgacagatctgagttctagcacccgc

21、attgaaagtcgtattagcctgaccgttacccgtagcaatcctgaactgc

22、gtaaagttttcgatagctttgttgaaggtggtcgtctgccgaccgcact

23、ggttgttgatctgtttggtaccgatgcatttgatgttgccgttgaatttc

24、atgttccgccttatattttctatccgaccaccgcaaatgttctgtcattc

25、ttcctgcatctgccgaaactggatgaaaccgttagttgcgaatttcgtg

26、aactgaccgaaccgctgatgctgccgggttgtgttccggttgcaggca

27、aagattttctggatcctgcccaggatcgtaaagatgatgcttataaatg

28、gctgctgcataataccaaacgttataaagaagcagaaggtattctggtg

29、aatacattcttcgaactggaaccgaatgcaattaaagcactgcaggaa

30、ccgggtctggataaaccgccggtatatccagtgggcccactggttaata

31、ttggtaaacaggaagcaaaacagaccgaagaaagcgaatgtctgaaa

32、tggctggataatcagccgctgggtagtgttctgtatgttagctttggta

33、gcggtggtaccctgacctgcgaacagctgaatgaactggcactgggc

34、ctggcagatagcgaacagcgttttctgtgggttatccgttctccgagtg

35、gtattgccaatagctcttattttgattctcattctcagaccgatccgctg

36、acctttctgcctcctggttttctggaacgtaccaagaagcgtggttttg

37、ttattcctttttgggccccgcaggcacaggtactggctcatccttccac

38、cggtggttttctgacccattgcggttggaactccaccctggaatcagtt

39、gttagcggtattcctctgattgcctggccgctgtatgccgaacagaaaa

40、tgaatgcagttctgctgagcgaagatattcgtgcagccctgcgtccgc

41、gtgctggtgatgatggtctggttcgccgtgaagaagttgcgcgtgttg

42、ttaaaggtctgatggaaggtgaagaaggtaaaggtgttcgtaataaaa

43、tgaaagaactgaaagaagcagcatgtcgtgtgctgaaagatgatggt

44、accagtacgaaagcactgagcctggtggcgctgaaatggaaagcgcataagaaggaactggaacagaatggtaatcattaa。

45、第三方面，一种重组质粒，所述的重组质粒包括所述的糖基转移酶的编码基因。

46、上述的重组质粒构建如下：选择seq id no:1所示的碱基序列，5端位点为ndei，3端位点为xhoi内切酶，目标载体为pet28a，委托北京擎科生物科技股份有限公司进行基因合成

47、进一步，所述的重组质粒的载体为pet28a、pyes2中的至少一种。

48、第四方面，一种转化体，所述的转化体包括所述的重组质粒。其中转化体选自于大肠杆菌或酿酒酵母，优选为大肠杆菌。

49、上述的糖基转移酶atogt表达过程如下：采用上述的转化体进行扩大培养，当细胞密度达到od600＝0.5时，加入异丙基硫代半乳糖苷进行诱导培养一段时间，后离心收集转化体，转化体沉淀重悬于tris-hcl缓冲液中，进行匀质处理(例如1000bar，5min)至溶液变为半透明状态为止；随后离心，收集破碎细胞后离心得到的上清。准备ni-nte柱(nisepharosetm excel购自ge healthcare公司，17-3712-01)，超纯水洗，lysisi buffer洗，将上清过ni-nte柱，流穿两次，收集蛋白混合液经过结合柱没有结合部分；用wash buffer冲洗镍柱，除去镍柱上的杂蛋白，每次3ml，洗至少3次；用eluntion buffer洗脱目标条带，获得纯化的atogt，继而通过分子筛sd75(购自ge healthcare公司)获得纯度较高的糖基转移酶atogt。

50、第五方面，一种槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙的制备方法，包括如下步骤：采用所述糖基转移酶通过酶催化制备槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙。糖基转移酶用于槲皮素-4'-o-β-d-葡萄糖甙羟基3位糖基化反应得到槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙。

51、其中槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙可以用于合成膳食补充剂，或功能性食品成分，或用于制药，或食品工业的有价值的植物化学物质中；优选为其用于合成自由基清除剂和心脏保护剂中。

52、采用上述方案的有益效果是：本发明atogt能够催化底物100％完全转化生成产物，将所述的糖基转移酶用于槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙的合成反应，与化学法相比，化学反应步骤比较简化、不需要低温控制。

53、进一步，包括如下具体的步骤：将含有tris-hcl缓冲液、尿苷二磷酸葡萄糖、槲皮素-4'-o-β-d-葡萄糖甙的反应体系在所述糖基转移酶作用下进行酶促反应，制备得到槲皮素-3,4'-二-o-β-d-葡萄糖甙。

54、进一步，所述尿苷二磷酸葡萄糖与所述槲皮素-4'-o-β-d-葡萄糖甙的摩尔比为3.5-4：0.1-0.5，优选为3.75：0.25；所述糖基转移酶与所述槲皮素-4'-o-β-d-葡萄糖甙的用量比(69-92)μg：(0.1-0.5)mmol，优选为69μg：0.25mmol。其中tris-hcl缓冲液只要满足要求上述的反应的要求即可。

55、进一步，酶促反应的温度为20-40℃，优选为30℃，时间为6-24小时，优选为12小时。