基于氟修饰gDNA增强Ago对dsDNA切割活性的方法及其应用

本发明涉及一种增强ago对dsdna切割活性的方法，具体涉及一种基于氟修饰gdna增强ago对dsdna切割活性的方法及其应用。

背景技术：

1、限制性内切酶是重组dna技术的重要工具，是一种细菌蛋白质，识别特定的dna序列，并在识别部位或附近切割dna，可用于分子生物学的常规用途。然而，众所周知，传统的限制性内切酶通常识别和切割4～6个核苷酸序列，使其受到特定的靶序列限制。

2、近年来在许多细菌和大多数古生菌中，存在规则成簇间隔的短回文重复序列，即crispr(clustered regularly interspaced shortpalindromic repe ats)序列。在cas(crispr-associated)效应蛋白的协助下，crispr/cas系统特异性结合靶标核酸，并作为获得性免疫系统，防御病毒和其他外来dna的侵入。

3、由于crispr/cas系统具有较高特异性和灵敏度，可作为核酸检测的新型生物传感平台，已在多个检测领域发挥重要作用。crispr-cas能在一段向导rna(guide rna)辅助下，特异性识别和切割目标dna序列。根据cas的功能，crispr/cas系统分为i类和ii类两大类，其中ii类是目前研究较多、应用较广泛的系统。ii类crispr/cas系统是由rna介导的cas蛋白系统，包括cas9(ii型)、cas12(v型)、cas13(vi型)和cas14(v型)，尽管它们结构组成本质上不同，但都可形成cas/grna二元复合物作为生物识别元件(参见图1)。cas9/grna复合物在靶序列原间隔子相邻序列(pam)位点附近的特定位点切割dsdna。cas12在grna的引导下靶向pam附近的dna序列进行识别，并在特定位置切割靶链。据报道cas13依赖原间隔子侧翼序列(pfs)，由grna引导rna靶向系统。目前研究较多的crispr-cas系统如cas9和cas12，对靶标的识别和切割均受到pam(protospacer adjacentmotif)位点的限制，对检测序列有要求；另外cas9和cas12系统均在grna指引下特异性识别靶标，但rna存在容易降解及价格昂贵等问题。

4、argonaute蛋白是一类广泛存在于自然界生物体内的蛋白质家族，根据来源可分为真核argonaute蛋白质(eukaryotic argonaute proteins，eagos)和原核argonaute蛋白质(prokaryotic argonaute proteins，pagos)。全长的pagos，根据其结构域，pagos可以分为三类：长pagos、短pagos和piwi-re蛋白，目前在结构和功能上研究较多的是长pagos。长pagos与eagos有着非常相似的结构域，都形成了双叶的支架形状，其中一个叶上包含氨基末端结构域(nterminal)和piwi-argonaute-zwile(paz)结构域，另一叶上包含中间结构域(mid)和piwi结构域。其中mid和paz结构域通常会形成结合口袋用来锚定寡核苷酸的5’端和3’端，在结合到靶标后，具有催化活性的piwi结构域则会介导目标链的切割，然后氨基末端结构域则会促进被裂解靶链的解离和释放。pagos在体外性质和生理功能上具有更广泛的多样性，并且不同于crispr/cas系统，pagos的核酸向导相比于cas效应蛋白的更短，并且靶向区域无特殊序列的限制，因此在体外应用方面更具有优势。

5、argonaute蛋白可以利用短的、互补的gdna或者grna识别并切割dna或者rna序列(参见图2)，并在保护原核细胞免受dna入侵方面发挥重要作用。argonaute蛋白已经在生物技术中验证了应用于靶向切割核酸和核酸检测的能力，并有用于基因组编辑的潜能。目前应用核酸检测较多的是t.thermophilus argonaute(ttago)和pyrococcus furiosusargonaute(pfago)。ttago最佳反应温度为75℃，但由于ttago不具备解旋酶活性，在其最佳反应温度下dsdna结构打开不完全，故ttago目前应用于dsdna的检测较少。pfago的最佳反应温度为95℃，在该温度下dsdna双链结构可完全打开，但由于温度过高，gdna与靶标不易结合。另外，来自嗜中温细菌的clostridium butyricum(cbago)虽然最佳反应温度在37℃，具有体内基因编辑的潜力，但由于其对dsdna作用有限，使其应用受到限制。

6、ttago是研究和应用较多的pagos，具有以单核苷酸精确度特异性切割dna和rna的特性；以5’端磷酸基团单链dna(ssdna)为dna向导(guide dna，gdna)靶向切割单链dna或rna的能力。但是，ttago对双链dna(dsdna)的切割活性较差，特别是在温度相对较低的环境下(<70℃)。这种较差的dsdna切割活性降低了ttago在核酸检测方面的应用潜力，尤其是在一锅等温扩增方面的应用潜力很小，因为等温扩增分析反应温度几乎低于65℃。ttago切割dsdna活性差的原因是典型gdna与目标dsdna的同源链具有相同的结合能力。因此，探索提高ttago切割dsdna活性的新策略，增强其在核酸检测方面的应用是非常必要的，并且有望将该方法推广并应用于pagos。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于氟修饰gdna增强ago对dsdna切割活性的方法及其应用，解决了现有ago在其最佳反应温度下对dsdna切割活性差的问题，通过在糖环2’f修饰的gdna增强了ago的dsdna切割活性。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种基于氟修饰gdna增强ago对dsdna切割活性的方法，该方法包含：将3’端末尾连续3～4个核苷酸的糖环2’f修饰的gdna记为f-gdna，通过对gdna的3’端末尾连续3～4个核苷酸的糖环2’f修饰，提高了gdna的tm值，同时增强了gdna与ago的结合亲和力，从而增强ago对dsdna切割活性。

3、优选地，该方法包含：所述3’端糖环2’f修饰的核苷酸的个数为3个。

4、优选地，该方法的反应温度范围为60～75℃。

5、优选地，该方法的反应温度为65℃。

6、优选地，该方法的切割反应体系包含：2μm ttago、10μm f-gdna、1x反应缓冲液和0.5μm dsdna。

7、优选地，所述反应缓冲液包含：20mm tris-hcl、25mm氯化钾、10mm(nh4)2so4和2mmmgcl2；其中，所述tris-hcl的ph为8.4。

8、优选地，所述ago选自ttago、cbago、pfago。

9、本发明的另一目的是提供所述的方法在靶向切割核酸或核酸检测中的应用。

10、本发明基于氟修饰gdna增强ago对dsdna切割活性的方法及其应用，解决了现有ttago在其最佳反应温度下dsdna切割活性差的问题，具有以下优点：

11、本发明提出了通过化学修饰增加gdna的结合亲和力，显著提高ttago切割dsdna活性的方案。本发明通过氟修饰gdna提高ttago切割dsdna活性，将该方法名为f3-gdna辅助增强ttago活性(f3-gdnaassisted ttago activity enhancement，fate)，fate通过在糖环2’f(3’端单个2’f核苷酸)修饰的gdna增强了ttago的dsdna切割活性。ttago在65～85℃下具有活性，但当温度低于70℃时，对dsdna切割活性差，且与等温扩增技术一锅法结合应用困难。本发明与标准对应体系相比，f3-gdna/ttago系统对dsdna的切割活性提高了约100倍，并将最低反应温度从65℃降低到60℃，并在65℃时ttago活性较好，拓宽了ttago反应温度范围。

12、而且，本发明通过对gdna 3’端糖环的2’f修饰，发现当gdna3’端含三个2’f修饰的核苷酸时ttago切割dsdna的活性达到最佳。ttago具有以单核苷酸精确度特异性切割靶链的特性，fate系统对dsdna的切割具有高特异性从而实现了ttago的实际应用，为分子诊断提供了一个有用的poct(point ofcare testing，即时检验)工具，并为进一步实现pagos在核酸检测方面的广泛应用提出新策略。