生物素-阿糖胞苷前药的制备及其应用

本发明属于医药化工领域，具体是涉及了生物素-阿糖胞苷前药的制备及其应用。

背景技术：

1、阿糖胞苷(ara-c)是一种抗代谢药物，广泛用于治疗急性和慢性髓系白血病和其他恶性肿瘤。其化学结构类似于dna合成过程中必不可少的叶酸、嘌呤、嘧啶等细胞代谢物。在dna生物合成过程中，它可以与核苷酸竞争结合酶，从而阻止肿瘤细胞的增殖。然而，ara-c在药物应用中存在一些局限性，包括亲脂性弱、膜通透性差以及血浆半衰期短等。

2、生物素受体(biotin receptor，br)位于细胞表面，能够与生物素(biotin)结合并介导特定的细胞信号传导或生物学效应。br在许多肿瘤中过度表达而在正常细胞中低表达。与正常细胞相比，为了快速增殖，癌细胞需要额外的生物素。快速增值的恶性肿瘤细胞过表达生物素受体，以满足其对生物素的摄取。在多种癌细胞中观察到生物素过表达，包括宫颈癌细胞(hela)、肾癌(renca，rd0995)、肺癌(a549、m109)、卵巢癌(ov 2008，id8)、肥大细胞瘤(p815)和乳腺癌(4t1、jc、mmt06056)癌细胞系等。生物素与生物素受体的特异性相互作用已被探索用于开发各种生物素偶联的纳米载体，以增加各种肿瘤细胞对抗癌药物的摄取。

3、靶向特异性给药，通常被称为智能给药系统(dds)。dds可以将药物靶向递送到病变部位并以可控的方式释放，从而提高治疗效果并减少副作用。目前已经开发了多种对细胞外或细胞内刺激响应的dds，例如：ph、氧化还原、渗透压和酶等。载体主要用于克服药物分子的内在缺陷，如选择性低、毒性高以及水溶性和稳定性差等，并且有利于药物的递送。常用的载体包括抗体(如吉妥珠单抗hp67.6)、抗人表皮生长因子受体-2(her2单抗)、具有靶向作用的小分子(如叶酸，生物素)、有机聚合物(如聚乙二醇)和不饱和脂肪酸(如油酸)等。

4、为克服阿糖胞苷的缺陷，提高药物疗效，发明了一种阿糖胞苷前药纳米传递系统(dds)，该dds由酯键和酰胺键连接而成，通过生物素的靶向结合于肿瘤细胞表面的受体，提高药物的靶向性；通过生物素受体介导进入细胞，可增强肿瘤细胞对药物的摄取；进入细胞后通过二硫键和酰胺键实现氧化还原和ph刺激响应型释放，发挥抗肿瘤作用。这一设计显著提高了阿糖胞苷对肿瘤组织的靶向性，增强了癌细胞对阿糖胞苷的摄取，可有效增强阿糖胞苷的治疗效果。

技术实现思路

1、对于肿瘤患者，其快速增殖的癌细胞会过度表达生物素受体(br)以满足其对生物素的需求，所以生物素可以作为靶向肿瘤的配体。其次，肿瘤细胞内具有比正常细胞更高水平的还原性gsh和更低的ph。因此本发明将生物素通过一系列连接子(包括二硫键、酰胺键)与阿糖胞苷偶联，能更好的达到抑制肿瘤的作用。

2、本发明提供了一种生物素-阿糖胞苷偶联物的制备方法，所述生物素-阿糖胞苷偶联物的结构式如a1，a2，a3，a4，a5，a6。反应过程中间体如b1，b2，b3，b4，b5，b6，c1，c2，c3，c4，c5。

3、术语说明：

4、a1：生物素偶联阿糖胞苷，连接子为ho-r-s-s-r-oh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6))和丁二酸酐。

5、a2：生物素偶联阿糖胞苷，连接子为ho-r-oh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))和丁二酸酐。

6、a3：生物素偶联阿糖胞苷，连接子为h2n-r-s-s-r-nh2(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6))和丁二酸。

7、a4：生物素偶联阿糖胞苷，连接子为h2n-r-nh2(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))和丁二酸。

8、a5：生物素偶联阿糖胞苷，连接子为nh2-r-cooh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))。

9、a6：生物素偶联阿糖胞苷，连接子为ho-r-cooh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))。

10、b1：生物素偶联二硫代二烷基醇，连接子为ho-r-s-s-r-oh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6))。

11、b2：生物素偶联二元醇，连接子为：ho-r-oh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))。

12、b3：生物素偶联二硫代二烷基胺，连接子为h2n-r-s-s-r-nh2(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6)。

13、b4：生物素偶联二氨基烷烃，连接子为：h2n-r-nh2(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)。

14、b5：生物素偶联n-羟基琥珀酰亚胺。

15、b6：生物素偶联羟基烷酸，连接子为：ho-r-cooh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))。

16、c1：b1和丁二酸酐偶联。

17、c2：b2和丁二酸酐偶联。

18、c3：b3和丁二酸偶联。

19、c4：b4和丁二酸偶联。

20、c5：b5和氨基烷酸偶联，连接子为：nh2-r-cooh(r＝(-ch2-)n(n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12))。

21、本发明化合物编号与结构式编号完全对应，具有相同的指代关系，以化合物结构式为依据。

22、本发明提供以下技术方案：

23、一种生物素-阿糖胞苷前药纳米粒的制备方法，a1所示生物素-阿糖胞苷前药纳米粒的制备方法包括以下步骤：

24、(1)将生物素与ho-r-s-s-r-oh(r＝(-ch2-)n(n＝2～6))溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酯化，得到b1。

25、(2)将b1与丁二酸酐溶于反应溶剂，在催化剂存在的条件下进行酯化，得到c1。

26、(3)将c1与阿糖胞苷溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰化，得到a1，结构式如下：

27、

28、(4)称取a1溶于有机溶剂中，另取一定量超纯水于烧杯中，将所溶解的a1在匀速搅拌下滴入水溶液，溶液呈乳白色，带一定的蓝色乳光，制备成生物素-阿糖胞苷前药纳米粒。

29、优选的，上述反应所述步骤(1)～(3)的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的一种或多种(但不局限于以上三种)；所述反应步骤(1)和反应步骤(3)的脱水剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的一种(但不局限于以上三种)。

30、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应在惰性溶剂中进行；所述惰性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氧六环或n,n-二甲基甲酰胺中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

31、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应的温度为0～80℃。

32、优选的，上述反应所述反应步骤(4)的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

33、a2所示生物素-阿糖胞苷前药纳米粒的制备方法包括以下步骤：

34、(1)将生物素与ho-r-oh(r＝(-ch2-)n(n＝2～12))溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酯化，得到b2。

35、(2)将b2与丁二酸酐溶于反应溶剂，在催化剂存在的条件下进行酯化，得到c2。

36、(3)将c2与阿糖胞苷溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰化，得到a2，结构式如下：

37、

38、(4)称取a2溶于有机溶剂中，另取一定量超纯水于烧杯中，将所溶解的a1在匀速搅拌下滴入水溶液，溶液呈乳白色，带一定的蓝色乳光，制备成生物素-阿糖胞苷前药纳米粒。

39、优选的，上述反应所述步骤(1)～(3)的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的一种或多种(但不局限于以上三种)；所述反应步骤(1)和反应步骤(3)的脱水剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的一种(但不局限于以上三种)。

40、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应在惰性溶剂中进行；所述惰性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氧六环或n,n-二甲基甲酰胺中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

41、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应的温度为0～80℃。

42、优选的，上述反应所述反应步骤(4)的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

43、a3所示生物素-阿糖胞苷前药纳米粒的制备方法包括以下步骤：

44、(1)将生物素与h2n-r-s-s-r-nh2(r＝(-ch2-)n(n＝2～6))溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到b3。

45、(2)将b3与丁二酸溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到c3。

46、(3)将c3与阿糖胞苷溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到a3，结构式如下：

47、

48、(4)称取a3溶于有机溶剂中，另取一定量超纯水于烧杯中，将所溶解的a3在匀速搅拌下滴入水溶液，溶液呈乳白色，带一定的蓝色乳光，制备成生物素-阿糖胞苷前药纳米粒。

49、优选的，上述反应所述步骤(1)～(3)的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的一种或多种(但不局限于以上三种)；所述反应步骤(1)～(3)的脱水剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的一种(但不局限于以上三种)。

50、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应在惰性溶剂中进行；所述惰性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氧六环或n,n-二甲基甲酰胺中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

51、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应的温度为0～80℃。

52、优选的，上述反应所述反应步骤(4)的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

53、a4所示生物素-阿糖胞苷前药纳米粒的制备方法包括以下步骤：

54、(1)将生物素与h2n-r-nh2(r＝(-ch2-)n(n＝2～12))溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到b4。

55、(2)将b4与丁二酸溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到c4。

56、(3)将c4与阿糖胞苷溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到a4，结构式如下：

57、

58、(4)称取a4溶于有机溶剂中，另取一定量超纯水于烧杯中，将所溶解的a4在匀速搅拌下滴入水溶液，溶液呈乳白色，带一定的蓝色乳光，制备成生物素-阿糖胞苷前药纳米粒。

59、优选的，上述反应所述步骤(1)～(3)的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的一种或多种(但不局限于以上三种)；所述反应步骤(1)～(3)的脱水剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的一种(但不局限于以上三种)。

60、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应在惰性溶剂中进行；所述惰性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氧六环或n,n-二甲基甲酰胺中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

61、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应的温度为0～80℃。

62、优选的，上述反应所述反应步骤(4)的有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或四氢呋喃中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

63、a5所示生物素-阿糖胞苷前药的制备方法包括以下步骤：

64、(1)将生物素与n-羟基琥珀酰亚胺溶于反应溶剂，在脱水剂存在的条件下进行酯化，得到b5。

65、(2)将b5与nh2-r-cooh(r＝(-ch2-)n(n＝2～12))溶于反应溶剂，反应得到c5。

66、(3)将c5与阿糖胞苷溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰化，得到a5，结构式如下：

67、

68、优选的，上述反应所述步骤(3)的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的一种或多种(但不局限于以上三种)；所述反应步骤(1)和反应步骤(3)的脱水剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的一种(但不局限于以上三种)。

69、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应在惰性溶剂中进行；所述惰性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氧六环或n,n-二甲基甲酰胺中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

70、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(3)的反应的温度为0～80℃。

71、a6所示生物素-阿糖胞苷前药的制备方法包括以下步骤：

72、(1)将生物素与ho-r-cooh(r＝(-ch2-)n(n＝2～12))溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酯化反应，得到b6。

73、(2)将b6与阿糖胞苷溶于反应溶剂，在催化剂和脱水剂存在的条件下进行酰胺化反应，得到a6，结构式如下：

74、

75、优选的，上述反应所述步骤(1)～(2)的催化剂选自4-二甲氨基吡啶(dmap)、1-羟基苯并三唑(hobt)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)中的一种或多种(但不局限于以上三种)；所述反应步骤(1)～(2)的脱水剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edci)或2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)中的一种(但不局限于以上三种)。

76、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(2)的反应在惰性溶剂中进行；所述惰性溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、二氧六环或n,n-二甲基甲酰胺中任意一种，但不仅限于这些溶剂。

77、优选的，上述反应所述反应步骤(1)～(2)的反应的温度为0～80℃。

78、发明的有益效果：

79、本发明提供了一种生物素-阿糖胞苷前药的制备方法及其应用。该方法通过引入连接子将生物素与阿糖胞苷偶联，制备出一系列生物素-阿糖胞苷前药，再将生物素-阿糖胞苷偶联物用纳米沉淀法制为生物素-阿糖胞苷前药纳米粒。制备出的一系列生物素-阿糖胞苷前药具有显著的有益效果。该系列前药可以通过结合肿瘤细胞表面的生物素受体进入肿瘤细胞，提高阿糖胞苷对肿瘤的靶向性。含有二硫键的生物素-阿糖胞苷前药可在肿瘤细胞内高gsh环境响应性释放药物，发挥抗肿瘤作用。含有酰胺键的生物素-阿糖胞苷前药可在肿瘤微环境和肿瘤细胞内较低ph下响应性释放药物，发挥抗肿瘤作用。生物素-阿糖胞苷前药能提高肿瘤细胞对阿糖胞苷的摄取量，与阿糖胞苷原药相比，生物素-阿糖胞苷前药对肿瘤细胞的杀伤效应更好，展现出更强的肿瘤疗效。此外，本发明的制备方法条件温和，易于工艺放大，显示出良好的应用前景和有益效果。