一种生产唾液酸乳糖-N-新四糖的基因工程菌

本发明涉及一种生产唾液酸乳糖-n-新四糖的基因工程菌，属于微生物基因工程领域。

背景技术：

0、技术背景

1、人乳寡糖(human milk oligosaccharides，hmos)是继乳糖和脂肪后人乳中的第三大固体成分，含量大约在5～15g/l。研究表明，人乳喂养的新生儿患肠胃炎、急性中耳炎以及其他免疫类疾病的概率较非母乳喂养显著降低，甚至在未来的智商发育上都占据优势，产生肥胖和糖尿病的概率也会下降，这与人乳中的hmos密切相关。hmos作为母乳中重要的免疫活性成分，对婴幼儿健康及生长发育起到至关重要的作用，并且越来越多的动物和临床试验证实了hmos的有益特性，例如作为益生元维持肠道生态平衡、抵抗病原菌的黏附、免疫调节及促进神经系统发育和修复等多种功能活性。目前，已有200多种结构不同的hmo被鉴定和解析，包括岩藻糖基化的中性hmos、非岩藻糖基化的中性hmos和唾液酸化的酸性hmos。其中唾液酸化hmos约占12-14％，唾液酸乳糖-n-新四糖(sialylacto-n-tetraose c，ls t c)作为一种重要的唾液酸化hmo，结构上表示为neu5ac-α2,6-gal-β1,4-glcnac-β1,3-gal-β1,4-glc，由n-乙酰神经氨酸(neu5ac)和乳酰-n-新四糖(lnnt)单元组成的五糖结构。lst c是一种存在于糖蛋白和糖脂上的人乳寡糖，也是一种特异性人类jc多瘤病毒(jcv)识别基序。lst c在进行性多灶性白质脑病(pml)和抑制流感病毒中具有较好的研究潜力。

2、lst c的合成方法主要是化学合成和化学-酶法合成，其中涉及众多繁琐的保护和脱保护步骤，且成本相对昂贵。现有技术中，公开号为wo2023247537a1的专利提供了一种提升hmos混合物中lst c占比的方法，该方法以大肠杆菌出发构建了lst c生产菌株，通过对外源引入的糖基转移酶进行了筛选优化，并补充前体cmp-neu5ac，最终发酵液中lst c占比从10％提升到39.4％。该方法以提升lst c在发酵所得hmos中的纯度为目的，现有技术中尚无提升lst c产量的研究。

技术实现思路

1、[技术问题]

2、本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够高效生产lst c的基因工程菌。

3、[技术方案]

4、为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

5、本发明首先提供了一株基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，表达了β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、cmp-唾液酸合成酶以及唾液酸乳糖转移酶；

6、敲除了出发菌株基因组上的以下基因：udp-n-乙酰葡糖胺2-二聚酶编码基因wecb或甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因mtld；β-半乳糖苷酶编码基因lacz，唾液酸醛缩酶编码基因nana和6-磷酸果糖激酶编码基因pfka；

7、所述β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、cmp-唾液酸合成酶分别具有ncbi登录号为aac44084.1、aac44085.1、aak91728.1所示的氨基酸序列，所述唾液酸乳糖转移酶具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；

8、所述基因lacz、nana、pfka、wecb、mtld分别具有gene id为945006、947742、948412、944789、948117所示的核苷酸序列。

9、在一种实施方式中，以拷贝数为15～25的载体表达所述β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶的编码基因，以拷贝数为35～45的载体表达所述cmp-唾液酸合成酶、唾液酸乳糖转移酶的编码基因。

10、在一种实施方式中，所述拷贝数为15～25的载体包括但不限于质粒pcdfduet-1；所述拷贝数为35～45的载体表达包括但不限于质粒petduet-1。

11、在一种实施方式中，所述基因工程菌过表达了udp-glcnac模块相关酶、udp-gal模块相关酶或ctp辅因子再生相关酶；

12、所述udp-glcnac模块相关酶包括：葡萄糖胺-6-磷酸合成酶、葡萄糖胺合成酶、udp-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶中的至少一种；

13、所述udp-gal模块相关酶包括：磷酸葡萄糖异构酶、葡糖磷酸变位酶、utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶、udp-葡萄糖-4-差向异构酶中的至少一种；

14、所述ctp辅因子再生相关酶包括：核苷二磷酸激酶、胞苷酸激酶、ctp合成酶、ump激酶、尿苷/胞苷激酶中的至少一种。

15、在一种实施方式中，所述udp-glcnac模块相关酶包括：葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和葡萄糖胺合成酶；

16、所述udp-gal模块相关酶包括：葡糖磷酸变位酶、utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶和udp-葡萄糖-4-差向异构酶；

17、所述ctp辅因子再生相关酶包括：核苷二磷酸激酶和胞苷酸激酶。

18、在一种实施方式中，所述葡萄糖胺-6-磷酸合成酶、葡萄糖胺合成酶、udp-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶分别具有ncbi登录号为aac76752.1、aac76208.1、aac76753.1所示的氨基酸序列；

19、所述磷酸葡萄糖异构酶、葡糖磷酸变位酶、utp-葡萄糖-1-磷酸尿苷基转移酶、udp-葡萄糖-4-差向异构酶分别具有ncbi登录号为aac76995.1、aac73782.1、aac74318.1、aac73846.1所示的氨基酸序列；

20、所述核苷二磷酸激酶、胞苷酸激酶、ctp合成酶、ump激酶、尿苷/胞苷激酶分别具有ncbi登录号为aac75571.1、aac73996.1、aac75822.1、aac73282.1、aac75127.2所示的氨基酸序列。

21、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于e.coli mg1655、e.coli dh5α、e.coli bl21(de3)、e.coli jm109或e.coli hb101。

22、本发明还提供了一种生产唾液酸乳糖-n-新四糖的方法，所述方法包括：以唾液酸和乳糖为底物，利用上述的基因工程菌发酵生产唾液酸乳糖-n-新四糖。

23、在一种实施方式中，所述方法包括：以甘油为碳源，以唾液酸和乳糖为底物，利用上述基因工程菌为发酵菌株发酵生产唾液酸乳糖-n-新四糖。

24、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

25、(1)将所述基因工程菌接种于种子培养基，培养获得种子液；

26、(2)将步骤(1)获得的种子液以1％～10％的接种量，转接至发酵培养基，培养至od600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.1～0.8mmol/l的iptg，5～10g/l唾液酸，5～15g/l乳糖，发酵培养至少72h。

27、在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

28、(1)将所述基因工程菌接种于种子培养基，培养获得种子液；

29、(2)将步骤(1)获得的种子液以1％～10％的接种量，转接至发酵培养基，培养至od600值为10～20，加入终浓度为0.1～0.8mmol/l的iptg，5～10g/l唾液酸，5～15g/l乳糖；

30、(3)待发酵培养基中的甘油消耗完毕后，向发酵体系中流加补料培养基，发酵72～96h；

31、所述补料培养基含有：甘油和mgso4。

32、在一种实施方式中，所述培养或发酵的温度为20～40℃。

33、在一种实施方式中，所述发酵培养基中甘油的添加量为：15～25g/l。

34、在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：甘油15～25g/l，柠檬酸0.5～3g/l，磷酸二氢钾5～15g/l，磷酸氢二氨1～5g/l，七水硫酸镁1～5g/l，微量金属溶液5～15ml/l；所述微量金属溶液含有：柠檬酸三铁5～15g/l，七水硫酸锌1～5g/l，五水硫酸铜0.5～2g/l，一水硫酸锰0.1～1g/l，硼砂0.1～1g/l，七钼酸铵0.05～0.5g/l，二水氯化钙1～5g/l。可选的，所述发酵培养基含有：甘油25g/l，柠檬酸1.7g/l，磷酸二氢钾13.5g/l，磷酸氢二氨4g/l，七水硫酸镁1.4g/l，微量金属溶液10ml/l；所述微量金属溶液含有：柠檬酸三铁10g/l，七水硫酸锌2.25g/l，五水硫酸铜1.0g/l，一水硫酸锰0.35g/l，硼砂0.23g/l，七钼酸铵0.11g/l，二水氯化钙2.0g/l。

35、本发明还提供了上述基因工程菌，或上述方法在生产唾液酸乳糖-n-新四糖或含唾液酸乳糖-n-新四糖的产品中的应用。

36、有益效果

37、(1)本发明通过表达β-1,3-n-乙酰葡糖胺基转移酶lgta基因、β-1,4-半乳糖基转移酶lgtb基因、cmp-唾液酸合成酶neua基因、唾液酸乳糖转移酶基因bst*，形成了lst c的代谢通路；并通过模块组合策略形成两个模块，利用质粒拷贝数微调转录水平后，得到的重组菌z7的lst c产量显著高于其他组合，lst c产量达到了20.8mg/l。

38、(2)本发明通过敲除lst c代谢途径的旁支途径编码基因，优化前体udp-glcnac和udp-gal模块的供给平衡，形成ctp辅因子再生系统一系列操作，达到提高lst c产量的目的。最终获得一株lst c生产菌株zapw15，摇瓶产量为220.9mg/l，3-l发酵罐产量为922.2mg/l。