基于组织特异性CpG标记进行体液鉴定的试剂盒、引物组合及方法

本发明属于法医学检测，具体涉及一种基于组织特异性cpg标记进行体液鉴定的试剂盒、引物组合及方法，特别涉及利用dna甲基化敏感型限制性内切酶hha i对待测样本dna进行酶切，然后基于体液特异性差异甲基化标记(cpg)进行体液来源鉴定的检测方法。

背景技术：

1、在法医学鉴定中体液斑是常见的生物证据。识别体液的组织来源可以在生物证据和犯罪之间建立联系。目前依赖于通过化学、催化和免疫学分析或直接观察特定细胞来鉴定体液类型，psa是确证精液斑的理想检材，α-淀粉酶活性是大多数唾液鉴定方法的指标，基于鲁米诺试验进行外周血鉴定等。然而，这些方法的灵敏度低，且生物检材在环境中容易降解，容易出现假阳性或假阴性结果，这限制了它们的应用。最近开发了使用mrna和mirna的体液鉴定方法，rna具有较强的体液特异性及多重分析能力，但是，我们见到的生物检材大多长期暴露在恶劣的环境下，又因为rna极不稳定，所以限制了其在日常法医工作中的应用。还可以利用微生物来进行体液识别，但是关于微生物标志物识别混合体液样本的来源的研究较少，混合样品含有两种以上体液的微生物群落，这使得鉴定更加困难。随着表观遗传学的发展，dna甲基化慢慢成为了法医体液鉴定的热点，在表观遗传修饰在转录调控中起着至关重要的作用。目前已经有很多研究利用体液特异性dna甲基化标记进行体液来源鉴定。分析方法主要有亚硫酸氢盐转化法，但该方法会导致dna降解的不良副作用。以及甲基化敏感型限制性内切酶(msre)消化法，该方法可以消化酶识别序列中的未甲基化cpg位点，而甲基化的cpg位点抵抗消化。甲基化状态可以通过dna消化后扩增的聚合酶链反应(pcr)产物的存在与否来确定，这种方法灵敏度高，耗时短，已应用于多项研究。

2、本发明首先使用dna甲基化敏感型限制性内切酶(msre)进行dna酶切，然后对组织特异性cpg标记进行复合扩增，基于毛细管电泳平台，建立了一种同时进行五种体液(精液、唾液、外周血、阴道分泌物和月经血)鉴定的检测方法。并且，法医学鉴定的最终目的是进行个体识别，该方法还可以结合商业化str试剂盒人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒(plus)进行共检测，将体液与供者紧密联系起来。

技术实现思路

1、本发明为了解决目前体液鉴定方法存在的鉴定困难的问题，提供了一种基于组织特异性cpg标记进行体液鉴定的试剂盒、引物组合及方法。

2、发明人选择组织特异性cpg标记。选择标准：(1)靶体液与其他体液有甲基化差异：在靶体液是甲基化的，在其他体液几乎未甲基化；(2)不同个体的相同体液的甲基化水平具有较小的差异(在人群中的个体差异＜0.2)；(3)甲基化位点是hha i的酶切序列(5’-gcgc-3’)或甲基化位点附近300bp内存在hha i的酶切序列(设计引物时扩增子应包含该序列)。(4)cpg标记(cg27322556)在任何组织种均无甲基化且含有hha i的酶切序列，我们将该段序列作为dc来评估酶切效率。管家基因actb(nc_000007.14)该段序列中不包含hha i的酶切序列，我们将其作为pc来评估pcr的扩增效率。

3、表1 7个标记的相关信息

4、

5、注：se代表精液、sa代表唾液、pb代表外周血、vg代表阴道分泌物、mb代表月经血。

6、本发明是通过以下技术方案实现的：基于组织特异性cpg进行体液鉴定的试剂盒，包括seq id no.1～14所示的7对特异性多重pcr引物，分别是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、actb、cg27322556。

7、作为本发明试剂盒技术方案的进一步改进，所述特异性多重pcr引物中，cg05261336的特异性pcr引物为seq id no.1的上游引物和seq id no.2的下游引物；

8、cg09107912的特异性pcr引物为seq id no.3的上游引物和seq id no.4的下游引物；

9、cg04011671的特异性pcr引物为seq id no.5的上游引物和seq id no.6的下游引物；

10、cg15988970的特异性pcr引物为seq id no.7的上游引物和seq id no.8的下游引物；

11、cg18069290的特异性pcr引物为seq id no.9的上游引物和seq id no.10的下游引物；

12、actb的特异性pcr引物为seq id no.11的上游引物和seq id no.12的下游引物；

13、cg27322556的特异性pcr引物为seq id no.13的上游引物和seq id no.14的下游引物。

14、作为本发明试剂盒技术方案的进一步改进，所述特异性多重pcr引物分别用于检测以下7个标记，分别是：1个精液特异性cpg标记、1个唾液特异性cpg标记、1个外周血特异性cpg标记、1个阴道分泌物特异性cpg标记、1个月经血特异性cpg标记、1个评估pcr扩增效果的管家基因actb以及1个评估酶切效果的cpg标记。

15、作为本发明试剂盒技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括用于检测pcr产物的去离子甲酰胺和分子量内标size-500plus。

16、本发明进一步提供了基于组织特异性cpg进行体液鉴定的试剂盒在体液成分鉴定中的应用。

17、作为本发明应用技术方案的进一步改进，所述体液为精液、唾液、外周血、阴道分泌物和月经血一种或多种。

18、本发明还提供了一种基于组织特异性cpg进行体液鉴定的引物组合，包括seq idno.1～14所示的7对特异性多重pcr引物，分别是cg05261336、cg09107912、cg04011671、cg15988970、cg18069290、actb、cg27322556。

19、本发明更进一步提供了一种基于组织特异性cpg进行体液来源检测的方法，包括以下步骤：

20、1)提取待测样本dna，使用dna甲基化敏感型限制性内切酶hha i对待测样本的dna进行酶切作为之后扩增的模板；

21、2)利用所述seq id no.1～14所示的7对pcr引物，通过多重特异性pcr得到扩增产物；

22、3)通过3500dna测序仪对产物进行检测，通过genemapper id v3.2对其进行分析。

23、本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

24、与现有技术相比，本发明具有以下优势：

25、1)本发明所述试剂盒基于dna甲基化敏感型限制性内切酶对待测样本的dna进行酶切，然后进行多重pcr扩增，快速，简便；

26、2)本发明所述试剂盒基于毛细管电泳平台，该平台在基层法医中较为常用，该技术简便易行，成本较低，便于在基层普及；

27、3)本发明所述检测方法可同时检测包含精液、唾液、外周血、阴道分泌物和月经血在内的5种体液；该检测方法的组织特异性cpg标记的扩增子可与商业化试剂盒人类strtyper-21g扩增荧光检测试剂盒(plus)实现共检测，即cpg标记扩增子长度和该试剂盒的str扩增子长度不冲突。因此将二者pcr产物混合上机，可以将体液来源信息与其供者完美联系起来，为法医鉴定提供一种新的思路。