单细胞水平鉴定食蟹猴TCR/BCR多样性的引物组的制作方法

本发明涉及单细胞水平鉴定食蟹猴tcr/bcr多样性的引物组，属于单细胞测序。

背景技术：

1、淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布广泛。t淋巴细胞(t cell)和b淋巴细胞(b cell)主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于t细胞受体(t cellrecptor,tcr)和b细胞受体(b cell recptor,bcr)，tcr和bcr这两种抗原识别受体的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子。研究证实，tcr和bcr这两种抗原识别受体一般由可变区(v区)、多变区(d区)、连接区(j区)以及恒定区(c区)构成，v(d)j区域在遗传过程中发生重排或重组，形成大量不同的组合形式，导致bcr和tcr基因序列多样性极其丰富，这些序列多样性集合称为免疫组库。而免疫组库测序就是以t/b淋巴细胞为检测对象，针对t/b淋巴细胞的抗原识别受体进行多样性检测，进而全面评估tcr/bcr的多样性。

2、在组成结构上，tcr和bcr这两种抗原识别受体均由两条不同链连接而成，tcr由α链和β链/γ链和δ链这两种肽链组成，α链、β链、γ链和δ链相应的编码基因为tcra、tcrb、tcrg和tcrd，bcr由2条重链igh和2条轻链igκ+igλ组成，igh包括iga、igd、ige、igg和igm，iga、igd、ige、igg、igm、igκ和igλ相应的编码基因为igha、ighd、ighe、ighg、ighm、igk和igl。其中，α链和轻链受基因片段vjc区域编码，组合形式相对简单，β链和重链受基因片段v(d)jc区域编码。一般外周血中，tcrαβ表达的t细胞占据了95％～99％，而tcrγδ表达的t细胞只有1％～5％。

3、非人灵长类动物指具有许多与人类相似的生物学特征的灵长类动物。由于和人类共享93％～98％的相同dna，并且，具有和人类相似的大脑解剖结构和身体系统，因此，非人灵长类动物在神经科学、神经退行性疾病、传染病、免疫疗法、生殖、衰老和慢性炎症疾病等的科学研究中均具有不可替代的地位。现阶段，比较常见的作为实验动物被用于科学研究的非人灵长类动物主要包括恒河猴(macacamulatta)和食蟹猴(macaca fascicularis)这两种。由于食蟹猴繁殖较快，且其体重一般为4千克～5千克，相比平均7千克重的恒河猴体型较小，导致用药量也相应偏小，因此，从上世纪70年代起，实验用猴应用已经全面转向了食蟹猴。在此基础上，由于tcr和bcr在机体免疫反应、肿瘤微环境和炎症疾病等领域均发挥重要的作用，因此，通过免疫组库测序对食蟹猴tcr和bcr的多样性进行特异性鉴定至关重要。

4、现阶段，商业化单细胞平台(如10x genomics的单细胞5’转录组+免疫组库测序)可以完成单细胞的捕获和5’全长cdna的扩增，并以5’全长cdna为模板，利用巢式扩增原理富集tcr或bcr，得到tcr或bcr的cdna，然后建库，得到tcr的v(d)j文库和bcr的v(d)j文库，再利用二代测序平台测序，最后根据测序结果进行数据分析，得到tcr或bcr的多样性。此技术不仅可以了解单个细胞的tcr/bcr克隆型，还可以联合单细胞转录组数据深入挖掘生命机理，为免疫组学研究提供更高效的平台，在肿瘤微环境、感染性疾病和自身免疫疾病等研究领域有着广泛的应用前景。但是，目前的商业化平台仅局限于人和小鼠的tcr或bcr分析，对其他物种没有合适的解决方案，如食蟹猴。因此，亟需开发出单细胞水平的对食蟹猴tcr和bcr的多样性进行单细胞水平特异性鉴定的方法。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种用于单细胞水平特异性鉴定食蟹猴tcr和/或bcr多样性的引物组，所述引物组包括靶向tcr的引物组和/或靶向bcr的引物组；所述靶向tcr的引物组包括靶向tcrb的引物组和/或靶向tcra的引物组；所述靶向bcr的引物组包括靶向igha的引物组、靶向ighd的引物组、靶向ighe的引物组、靶向ighg的引物组、靶向ighm的引物组、靶向igl的引物组和/或靶向igk的引物组；

2、所述靶向tcrb的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧(inner)引物；

3、所述靶向tcra的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧(inner)引物；

4、所述靶向igha的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧(inner)引物；

5、所述靶向ighd的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧(inner)引物；

6、所述靶向ighe的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧(inner)引物；

7、所述靶向ighg的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧(inner)引物；

8、所述靶向ighm的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.14或seq id no.16所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq idno.15或seq id no.17所示的反向内侧(inner)引物；

9、所述靶向igl的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧(inner)引物；

10、所述靶向igk的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.20或seq id no.22所示的反向外侧(outer)引物和核苷酸序列如seq idno.21或seq id no.23所示的反向内侧(inner)引物。

11、在本发明的一种实施方式中，所述靶向tcrb的引物组由核苷酸序列如seq idno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seqid no.3所示的反向内侧引物组成；

12、所述靶向tcra的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物组成；

13、所述靶向igha的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物组成；

14、所述靶向ighd的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物组成；

15、所述靶向ighe的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物组成；

16、所述靶向ighg的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物组成；

17、所述靶向ighm的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.14或seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.15或seq id no.17所示的反向内侧引物组成；

18、所述靶向igl的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物组成；

19、所述靶向igk的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.20或seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.21或seqid no.23所示的反向内侧引物组成。

20、在本发明的一种实施方式中，所述引物组由靶向tcr的引物组和靶向bcr的引物组组成；所述靶向tcr的引物组由靶向tcrb的引物组和靶向tcra的引物组组成；所述靶向bcr的引物组由靶向igha的引物组、靶向ighd的引物组、靶向ighe的引物组、靶向ighg的引物组、靶向ighm的引物组、靶向igl的引物组和靶向igk的引物组组成。

21、在本发明的一种实施方式中，所述靶向ighm的引物组由核苷酸序列如seq idno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物组成；所述靶向igk的引物组由核苷酸序列如seq idno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物组成。

22、本发明还提供了一种用于单细胞水平特异性鉴定食蟹猴tcr和/或bcr多样性的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

23、在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒还包括pcr扩增所需试剂和/或扩增产物纯化所需试剂。

24、在本发明的一种实施方式中，所述pcr扩增所需试剂包括巢式pcr所需试剂。巢式pcr是一种变异的聚合酶链反应，使用两对(而非一对)pcr引物扩增完整的片段。第一对pcr引物扩增片段和普通pcr相似，称为外侧(outer)引物。第二对引物结合在第一次pcr产物内部，使得第二次pcr扩增片段短于第一次扩增，称为内侧(inner)引物。巢式pcr的优势在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式pcr的扩增非常特异。

25、在本发明的一种实施方式中，所述巢式pcr所需试剂包括amp mix和/或无酶水。

26、本发明还提供了一种用于单细胞水平特异性鉴定食蟹猴tcr和/或bcr多样性的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法包括：使用上述引物组或上述试剂盒对食蟹猴tcr和/或bcr多样性进行单细胞水平特异性鉴定。

27、在本发明的一种实施方式中，所述方法包括5’转录组cdna扩增步骤、tcr扩增步骤、tcr文库构建步骤以及文库测序和数据分析步骤；或者，所述方法包括5’转录组cdna扩增步骤、bcr扩增步骤、bcr文库构建步骤以及文库测序和数据分析步骤；或者，所述方法包括5’转录组cdna扩增步骤、tcr扩增步骤、bcr扩增步骤、tcr和bcr文库构建步骤以及文库测序和数据分析步骤；

28、所述5’转录组cdna扩增步骤为：将取自食蟹猴的不同样本制备成单细胞悬液后，对单细胞悬液进行单细胞捕获、纯化和扩增，得到5’转录组的全长cdna，将5’转录组的全长cdna作为tcr和/或bcr的扩增模板；

29、所述tcr扩增步骤为：在扩增模板中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第一轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；对第一轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到第一轮纯化产物；在第一轮纯化产物中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第二轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物；对第二轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到tcr扩增产物；

30、所述bcr扩增步骤为：在扩增模板中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.12所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第一轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；对第一轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到第一轮纯化产物；在第一轮纯化产物中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq idno.11所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第二轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物；对第二轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到bcr扩增产物；

31、所述tcr和/或bcr文库构建步骤为：使用tcr扩增产物和/或bcr扩增产物进行tcr和/或bcr的文库构建；

32、所述文库测序和数据分析步骤为：对文库进行测序和分析，得到食蟹猴tcr和/或bcr的多样性结果。

33、在本发明的一种实施方式中，所述5’转录组cdna扩增步骤中：按照按照10xgenomics chromiumnext gem single cell 5'reagent kits v2(dual index)(sop号：cg000331rev e)对单细胞悬液进行单细胞捕获、纯化和扩增，得到5’转录组的全长cdna。

34、在本发明的一种实施方式中，所述tcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq idno.4所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm。

35、在本发明的一种实施方式中，所述tcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.4所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5μm；核苷酸序列如seqid no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5μm。

36、在本发明的一种实施方式中，所述tcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为63～65℃、扩增循环数为11～13；第二轮pcr扩增的退火温度为63～65℃、扩增循环数为9～11。

37、在本发明的一种实施方式中，所述tcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为64℃、扩增循环数为12；第二轮pcr扩增的退火温度为64℃、扩增循环数为10。

38、在本发明的一种实施方式中，所述bcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.8所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq idno.9所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm。

39、在本发明的一种实施方式中，所述bcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.8所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为1μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seqid no.13所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为1μm。

40、在本发明的一种实施方式中，所述bcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为61～63℃、扩增循环数为7～9；第二轮pcr扩增的退火温度为61～63℃、扩增循环数为7～9。

41、在本发明的一种实施方式中，所述bcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为62℃、扩增循环数为8；第二轮pcr扩增的退火温度为62℃、扩增循环数为8。

42、在本发明的一种实施方式中，所述tcr和/或bcr文库构建步骤中，使用tcr扩增产物和/或bcr扩增产物根据10x genomics《cg000331_chromiμmnextgemsinglecell5-v2_userguide_reve》step 4v(d)j library construction进行tcr和/或bcr的文库构建。

43、在本发明的一种实施方式中，所述文库测序和数据分析步骤中，利用illuminanovaseq6000，pe150策略对文库进行测序；按照10x genomics cellranger(版本：v 6.1.2)对每个样品进行分析，得到每个样品的表达矩阵。

44、在本发明的一种实施方式中，所述取自食蟹猴的不同样本包括取自食蟹猴的组织样本、血液样本和/或骨髓样本。

45、在本发明的一种实施方式中，所述单细胞悬液含有外周血单个核细胞、骨髓单个核细胞和/或胸腺细胞等。

46、本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒或上述方法在食蟹猴tcr和/或bcr多样性鉴定中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

47、本发明技术方案，具有如下优点：

48、1、本发明提供了一种用于单细胞水平特异性鉴定食蟹猴tcr和/或bcr多样性的引物组，所述引物组包括靶向tcr的引物组和/或靶向bcr的引物组；所述靶向tcr的引物组包括靶向tcrb的引物组和/或靶向tcra的引物组；所述靶向bcr的引物组包括靶向igha的引物组、靶向ighd的引物组、靶向ighe的引物组、靶向ighg的引物组、靶向ighm的引物组、靶向igl的引物组和/或靶向igk的引物组；所述靶向tcrb的引物组包括核苷酸序列如seq idno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seqid no.3所示的反向内侧引物；所述靶向tcra的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物；所述靶向igha的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物；所述靶向ighd的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物；所述靶向ighe的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物；所述靶向ighg的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物；所述靶向ighm的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seqid no.14或seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.15或seq idno.17所示的反向内侧引物；所述靶向igl的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物；所述靶向igk的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.20或seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seqid no.21或seq id no.23所示的反向内侧引物。使用此引物组能够实现单细胞水平的食蟹猴tcr和bcr的特定性鉴定方法，同时，可以兼容现有的单细胞商业化平台(如10x genomics的单细胞5’转录组+免疫组库测序，但不限于该平台)，极具应用前景。

49、进一步地，所述靶向ighm的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物组成；所述靶向igk的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物组成。使用此引物组在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

50、2、本发明提供了一种用于单细胞水平特异性鉴定食蟹猴tcr和/或bcr多样性的试剂盒，所述试剂盒包括引物组；所述引物组包括靶向tcr的引物组和/或靶向bcr的引物组；所述靶向tcr的引物组包括靶向tcrb的引物组和/或靶向tcra的引物组；所述靶向bcr的引物组包括靶向igha的引物组、靶向ighd的引物组、靶向ighe的引物组、靶向ighg的引物组、靶向ighm的引物组、靶向igl的引物组和/或靶向igk的引物组；所述靶向tcrb的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物；所述靶向tcra的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物；所述靶向igha的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物；所述靶向ighd的引物组包括核苷酸序列如seq idno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seqid no.9所示的反向内侧引物；所述靶向ighe的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq idno.11所示的反向内侧引物；所述靶向ighg的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物；所述靶向ighm的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.14或seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.15或seq id no.17所示的反向内侧引物；所述靶向igl的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物；所述靶向igk的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.20或seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.21或seq id no.23所示的反向内侧引物。使用此试剂盒能够实现单细胞水平的食蟹猴tcr和bcr的特定性鉴定方法，同时，可以兼容现有的单细胞商业化平台(如10x genomics的单细胞5’转录组+免疫组库测序，但不限于该平台)，极具应用前景。

51、进一步地，所述靶向ighm的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物组成；所述靶向igk的引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物组成。使用含此引物组的试剂盒在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

52、3、本发明提供了一种用于单细胞水平特异性鉴定食蟹猴tcr和/或bcr多样性的方法，所述方法使用引物组或试剂盒对食蟹猴tcr和/或bcr多样性进行单细胞水平特异性鉴定；所述试剂盒包括引物组；所述引物组包括靶向tcr的引物组和/或靶向bcr的引物组；所述靶向tcr的引物组包括靶向tcrb的引物组和/或靶向tcra的引物组；所述靶向bcr的引物组包括靶向igha的引物组、靶向ighd的引物组、靶向ighe的引物组、靶向ighg的引物组、靶向ighm的引物组、靶向igl的引物组和/或靶向igk的引物组；所述靶向tcrb的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物；所述靶向tcra的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物；所述靶向igha的引物组包括核苷酸序列如seqid no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物；所述靶向ighd的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq idno.9所示的反向内侧引物；所述靶向ighe的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物；所述靶向ighg的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物；所述靶向ighm的引物组包括核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.14或seq id no.16所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq idno.15或seq id no.17所示的反向内侧引物；所述靶向igl的引物组包括核苷酸序列如seqid no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物；所述靶向igk的引物组包括核苷酸序列如seq idno.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.20或seq id no.22所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.21或seq id no.23所示的反向内侧引物。使用此方法能够实现单细胞水平的食蟹猴tcr和bcr的特定性鉴定方法，同时，可以兼容现有的单细胞商业化平台(如10x genomics的单细胞5’转录组+免疫组库测序，但不限于该平台)，极具应用前景。

53、进一步地，所述方法包括5’转录组cdna扩增步骤、tcr扩增步骤、tcr文库构建步骤以及文库测序和数据分析步骤；或者，所述方法包括5’转录组cdna扩增步骤、bcr扩增步骤、bcr文库构建步骤以及文库测序和数据分析步骤；或者，所述方法包括5’转录组cdna扩增步骤、tcr扩增步骤、bcr扩增步骤、tcr和bcr文库构建步骤以及文库测序和数据分析步骤；其中，tcr扩增步骤为：在扩增模板中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第一轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；对第一轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到第一轮纯化产物；在第一轮纯化产物中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第二轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物；对第二轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到tcr扩增产物；bcr扩增步骤为：在扩增模板中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.16所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.18所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第一轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第一轮pcr扩增，得到第一轮pcr扩增产物；对第一轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到第一轮纯化产物；在第一轮纯化产物中加入核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq idno.13所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物和巢式pcr所需试剂，得到第二轮pcr扩增体系；对pcr扩增体系进行第二轮pcr扩增，得到第二轮pcr扩增产物；对第二轮pcr扩增产物进行片段纯化，得到bcr扩增产物。使用此方法能够实现单细胞水平的食蟹猴tcr和bcr的特定性鉴定方法，同时，可以兼容现有的单细胞商业化平台(如10x genomics的单细胞5’转录组+免疫组库测序，但不限于该平台)，极具应用前景。

54、进一步地，所述tcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

55、进一步地，所述tcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.4所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.3所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.5所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5μm。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

56、进一步地，所述tcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为63～65℃、扩增循环数为11～13；第二轮pcr扩增的退火温度为63～65℃、扩增循环数为9～11。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

57、进一步地，所述tcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为64℃、扩增循环数为12；第二轮pcr扩增的退火温度为64℃、扩增循环数为10。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

58、进一步地，所述bcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq idno.19所示的反向内侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为0.5～1μm。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

59、进一步地，所述bcr扩增步骤中，核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.6所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.8所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.10所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.12所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq id no.16所示的反向外侧引物、核苷酸序列如seq idno.18所示的反向外侧引物和核苷酸序列如seq id no.22所示的反向外侧引物在第一轮pcr扩增体系中的浓度分别为1μm；核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物、核苷酸序列如seq id no.7所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.9所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.11所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.13所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.17所示的反向内侧引物、核苷酸序列如seq id no.19所示的反向内侧引物和核苷酸序列如seq id no.23所示的反向内侧引物在第二轮pcr扩增体系中的浓度分别为1μm。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

60、进一步地，所述bcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为61～63℃、扩增循环数为7～9；第二轮pcr扩增的退火温度为61～63℃、扩增循环数为7～9。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。

61、进一步地，所述bcr扩增步骤中，第一轮pcr扩增的退火温度为62℃、扩增循环数为8；第二轮pcr扩增的退火温度为62℃、扩增循环数为8。该条件下使用此方法在单细胞水平对食蟹猴tcr和bcr进行特定性鉴定的质控结果更佳且检出率更高。