一种淀粉制品掺杂检测的方法

本发明涉及食品加工，尤其涉及一种淀粉制品掺杂检测的方法。

背景技术：

1、谷物、块根和块茎作物衍生产品的日益多样化导致了食品真实性问题，例如粉条或粉丝等淀粉制品掺杂。粉条或粉丝等淀粉制品掺杂主要涉及在其制作过程中使用低价淀粉代替高价淀粉，对食品安全和消费者信任产生负面影响。因此，迫切需要有效的粉条或粉丝掺杂识别技术。

2、基于dna的食品掺杂识别是特异性和稳定的，因为dna可以从大多数细胞中提取，并且在高温下是稳定的。dna检测已逐渐成为评估食物真实性的关键，其成功与否取决于提取足够数量的可扩增dna。然而，从粉条或粉丝等淀粉制品中提取高质量和足量的dna是非常具有挑战性的，因为大多数淀粉制品中仅含有少量dna。因此，急需建立一种快速、有效的淀粉制品dna提取方法，以推进dna检测技术在淀粉制品掺杂中的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种淀粉制品掺杂检测的方法，所述方法通过测定粉条或粉丝等淀粉制品中dna序列的异同实现。本发明操作简单、dna提取率高、检出限低，易于粉条或粉丝等淀粉制品的快速精准识别，易于大规模推广、

2、本发明首先提供一种提取淀粉制品中dna的方法，包括：

3、s1，将淀粉制品与水混合，进行能量聚集型超声处理；

4、所述能量聚集型超声处理的功率密度为20-60w/l，温度为50-65℃，处理时间为5-20min；

5、s2，研磨；用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取，获得水相；

6、s3，将所述水相进行能量发散型超声处理；然后纯化，获得dna；

7、所述能量发散型超声的处理功率密度为20-60w/l，温度为50-65℃，处理时间为5-20min。

8、具体地，所述淀粉制品为粉条或粉丝，其原料可选自甘薯、马铃薯、木薯、玉米中的一种或多种，但不限于此。

9、在一些实施例，所述淀粉制品还包括淀粉，例如甘薯淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉中的一种或多种。

10、淀粉制品中dna含量极低，通常为痕量；且由于淀粉制品本身的特性，其中的dna很难提取。本发明人通过大量实践发现，先对淀粉制品进行能量聚集型超声处理，可破坏其微观结构和结晶结构，呈现更小的颗粒和碎片结构，黏度和糊化焓值降低，从而显著提高dna提取率和纯度，pcr扩增效果更好，结果可靠准确。

11、具体地，所述能量聚集型超声处理是指采用探头式超声波装置对样品进行处理。

12、优选地，所述能量聚集型超声处理的功率密度为30-50w/l，温度为55-60℃，处理时间为10-20min。进一步优选地，所述能量聚集型超声处理的功率密度为50w/l，温度为60℃，处理时间为15min。

13、具体地，步骤s1中，以g/ml计，可将淀粉制品与蒸馏水按质量与体积比1:1混合，然后进行能量聚集型超声处理。

14、本发明所述十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法可用常规技术。

15、优选地，所用ctab缓冲液中含有0.02-0.03％β-巯基乙醇或0.05％-0.2％10mg/ml蛋白酶k。进一步优选地，ctab缓冲液中含有0.025％β-巯基乙醇或0.1％10mg/ml蛋白酶k。

16、具体地，步骤s2包括：取0.4-4g能量聚集型超声处理的淀粉制品，研磨，转移到预装有2-20ml 2％(w/w)ctab缓冲液的离心管中，涡旋30s-1min，在60℃下孵育30-120min，加入0.3-3ml氯仿:异戊醇(24:1)，通过倒置轻轻混合30s-2min，在4℃于8000g离心15min，得到水相。

17、具体地，所述能量发散型超声处理是指采用安装有超声振板的超声波清洗装置对样品进行处理。

18、优选地，所述能量发散型超声处理的功率密度为30-50w/l，温度为55-60℃，处理时间为10-20min。进一步优选地，能量发散型超声处理的功率密度为30w/l，温度为60℃，处理时间为10min。本发明研究发现，能量发散型超声处理可使淀粉制品中的dna可以更好地与提取过程水相中的其他残余成分解离，从而提高dna提取率、纯度和pcr扩增效果，提高检测的准确度。

19、然而，若仅进行能量聚集型超声处理或能量发散型超声处理；或在步骤s1使用能量发散型超声处理，在步骤s2使用能量聚集型超声处理，均不能有效提高dna提取率和纯度。

20、具体地，步骤s3纯化的方法包括：将能量发散型超声处理后的水相与冰冷的异丙醇混合，孵育，沉淀dna，离心除去异丙醇；将沉淀与乙醇混合，离心去除乙醇，干燥；加入超纯水或tris-edta缓冲液，混匀，获得dna。

21、更具体地，步骤s3纯化的方法包括：将能量发散型超声处理后的水相与冰冷的异丙醇混合，在-20℃下孵育20-120min以沉淀dna，在4℃于8000g离心10min以除去异丙醇。然后加入70-700μl 70％乙醇，在4℃下于6000g离心5min以去除乙醇，在室温下干燥20-60min。最后，加入20-200μl超纯水或tris-edta缓冲液并混匀，获得dna。

22、在一些具体实施例，所述提取淀粉制品中dna的方法包括：

23、s1，以g/ml计，将淀粉制品(粉丝或粉条)与蒸馏水按质量与体积比1:1混合，在功率密度50w/l、温度60℃条件下能量聚集型超声处理15min；

24、s2，取2g能量聚集型超声处理后的淀粉制品研磨；转移到预装有10ml含有0.025％β-巯基乙醇或0.1％10mg/ml蛋白酶k的2％(w/w)ctab缓冲液的离心管中，涡旋1min，在60℃下孵育60min，加入1.5ml氯仿：异戊醇(24:1)，通过倒置轻轻混合1min，在4℃于8000g离心15min，得到水相；

25、s3，将水相在功率密度30w/l、温度60℃条件下能量发散型超声处理10min，之后将冰冷的异丙醇加入水相中，在-20℃下孵育45min以沉淀dna，在4℃于8000g离心10min以除去异丙醇。然后加入350μl70％乙醇，在4℃下于6000g离心5min以去除乙醇，在室温下干燥30min。最后，加入100μl超纯水或tris-edta缓冲液并混匀，获得dna。

26、本发明还提供一种淀粉制品掺杂检测的方法，包括：

27、(1)按上述方法获得淀粉制品中的dna；

28、(2)利用实时荧光定量pcr对步骤(1)中所述dna进行扩增；

29、(3)根据淀粉制品特异性基因扩增曲线判定样品是否掺杂。

30、具体地，将淀粉制品特异性基因扩增曲线分析结果与所述淀粉制品标准样品dna扩增曲线进行比对，即可判断淀粉制品是否掺杂。

31、采用上述检测方法，以纯甘薯、马铃薯、木薯、玉米粉条或粉丝为标准样品，可用于识别甘薯、马铃薯粉条或粉丝中是否掺杂有木薯或玉米淀粉，达到快速、有效、精准监控甘薯、马铃薯粉条或粉丝质量的目的。本发明方法解决了粉条或粉丝等淀粉制品掺杂无法高效识别的问题，该检测方法主要是利用粉条或粉丝等淀粉制品中dna序列的异同来确定其是否掺杂。

32、所述步骤(2)中还包括确定循环阈值(ct值)。

33、所述步骤(3)包括将淀粉制品特异性基因扩增曲线分析结果与所述淀粉制品标准样品dna扩增曲线进行比对。

34、具体地，所述淀粉制品掺杂检测的方法包括：

35、(1)按上述方法获得淀粉制品中的dna；

36、(2)利用实时荧光定量pcr对步骤(1)中所述dna进行扩增，确定ct值；

37、(3)分析淀粉制品特异性基因扩增曲线，并与所述淀粉制品标准样品dna扩增曲线进行比对判定样品中含有何种来源dna。

38、本发明具有以下优点：

39、(一)本发明提供的淀粉制品检测方法实现了快速有效的dna提取，结合实时荧光定量pcr检测可以获得淀粉制品标准样品的扩增曲线。通过特异性基因扩增曲线的比较分析可以精准判定淀粉制品待测样品中含有何种来源dna。

40、(二)本发明提供的淀粉制品检测方法具有准确定性高、可初步定量的特点，能够检测出1％木薯或玉米淀粉掺杂的淀粉制品，能够满足消费者明白消费、健康饮食的需求，也可以给淀粉制品企业营造公平竞争的环境。

41、(三)本发明只需要能量聚集型和能量发散型超声装置、实时荧光定量pcr仪及离心机等设备，操作简单，易于粉条或粉丝等淀粉制品的快速精准识别，易于大规模推广。