一种茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法及其应用与流程

本发明属于基因检测，具体涉及一种茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法及其应用。

背景技术：

1、甲基化是dna分子上的一种化学修饰，甲基化是在dna甲基转移酶(dnamethyltransferase，dnmt)催化作用下，利用s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)提供甲基，在cpg二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程，甲基化可以影响基因的表达和细胞功能。

2、dna甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变dna的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。在人类基因组中大约有2800万个cpg位点，在正常体细胞中70％是甲基化状态。但dna甲基化并不是均匀分布在基因组中的，有些分散于dna序列中；另一些呈现高度聚集状态，称之为cpg岛，它们常位于转录调控区附近，与56％的人类基因组编码基因相关。因此甲基化检测在疾病的检测和临床诊断中具有重要的应用价值。

3、常用的甲基化检测方法主要包括：甲基化特异性pcr(msp)、甲基化特异性限制性内切酶消化(msre)、甲基化敏感性扩增片段长度多态性(ms-aflp)、甲基化敏感性dna芯片和甲基化测序等。

4、其中，msp是利用dna甲基化与未甲基化dna的不同性质，通过设计特异性扩增引物进行pcr扩增，从而区分甲基化和未甲基化dna序列。msre是利用某些限制性内切酶能够识别和切割甲基化的dna序列，未甲基化的dna序列则不会被切割。通过pcr扩增和酶切消化后的dna片段的比较，可以确定dna的甲基化状态。ms-aflp是结合了甲基化敏感性消化和扩增片段长度多态性技术，通过比较不同条件下dna的电泳图谱，可以检测dna上的甲基化差异。甲基化敏感性dna芯片方法是基于微阵列技术，利用甲基化敏感的酶或甲基结合蛋白与样品中的甲基化dna发生特异性结合，然后利用荧光标记的方法检测结合程度，从而实现快速和高通量的甲基化检测。甲基化测序方法是基于高通量测序技术，通过甲基化特异性捕获、测序和数据分析，可以获得全基因组的甲基化谱图，从而全面了解基因组中的甲基化变化。

5、对于甲基化检测技术，目前使用的通用的技术是亚硫酸盐转化技术，包括如下步骤：提取样本中的dna；对dna提取物用亚硫酸盐进行转化；再次进行dna纯化；用特异性引物探针进行pcr扩增；识别和分析甲基化信息。基于重亚硫酸盐转化的方法存在许多不足：1、重亚硫酸盐转化的dna样本需要经受严苛的化学处理过程，例如低ph、高温、高浓度的重亚硫酸盐等，这些条件会导致dna大量降解，有的甚至降解高达90％，模板完整性降低，因此所需的dna起始用量较大；2、重亚硫酸盐处理不彻底会导致未甲基化的胞嘧啶转化不完全，出现假阳性的结果，从而对dna甲基化情况产生错误的评估；3、未甲基化的胞嘧啶约占人基因组总胞嘧啶数的95％，将未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶则会严重降低序列复杂性，在对多种靶标分子进行同时检测时，引物设计更困难，可能导致检测准确性降低，以及增加检测成本；4、重亚硫酸盐转化处理时间长、后续需要反复洗涤纯化、操作繁琐，耗费大量的人力和时间。

6、因此，开发一种规避了亚硫酸盐转化的dna断裂、操作时间长、不能自动化等缺点的基因突变位点检测方法具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法及其应用。本发明的方法可以不用亚硫酸盐转化，利用酶切和连接的方法处理后，再进行pcr检测，具有操作时间短、可自动化、灵敏度和特异性高。规避了亚硫酸盐转化的dna断裂、操作时间长、不能自动化等缺点。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法，所述方法包括：采用识别特异性位点的内切酶识别含有被检测序列的双链核酸片段，所述含有被检测序列的双链核酸片段中含有特定酶切位点，酶切后形成含有特定酶切末端的双链片段，切割后加入茎环结构的dna片段，在dna连接酶的作用下进行片段连接，在dna聚合酶的作用下，加入与茎环结构的dna片段的环形区互补配对的环形引物进行pcr扩增延伸，得到扩增检测模板，再采用特异性探针对扩增检测模板进行检测，含有特定位点的核酸片段的样本有信号输出。

4、本发明中，采用特定酶对核酸的特定位点进行识别，之后进行切割，并在此基础上加入茎环结构的dna片段，用t4 dna连接酶或taq dna连接酶进行连接，然后进行特异性pcr扩增，含有特定位点的核酸片段的样本有信号输出。本发明的方法可实现特异性好、灵敏度高的dna甲基化、snp和其他突变的检测。

5、优选地，所述特定位点选自含有甲基化、snp或其他基因突变的位点。

6、优选地，所述特定酶切末端的序列明确。

7、优选地，所述茎环结构的dna片段用于捕获所述含有特定酶切末端的双链片段。

8、优选地，所述茎环结构5’端经磷酸化修饰。

9、优选地，所述茎环结构的dna片段从5’到3’由第二串联序列、茎环序列、第一串联序列、结合捕获序列依次连接得到。

10、优选地，所述第一串联序列与第二串联序列至少部分反向互补配对，折叠后形成茎环结构的dna片段。

11、本发明中，所述第一串联序列的长度为5-50nt，例如可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45或50等。

12、本发明中，所述第二串联序列的长度为5-50nt，例如可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45或50等。

13、本发明中，所述茎环序列的长度为10-100nt，例如可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90或100等。

14、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对，特异性捕获含有特定的酶切末端的核酸片段。

15、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对后，采用dna连接酶将第二串联序列的5’末端与核酸片段的3’末端连接。

16、优选地，所述环形引物从茎环结构的dna片段的环形区开始扩增，依次延伸至第二串联序列和切割后的核酸片段。

17、优选地，所述结合捕获序列还包括核酸延伸阻断修饰。

18、优选地，所述酸延伸阻断修饰位于结合捕获序列的3’端。

19、优选地，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：碳spacer、硫代基团、巯基、pna、ddatp、ddttp、ddctp、ddgtp、pna或氨基等。

20、优选地，所述扩增检测模板从5’到3’依次包括环形引物序列、与第二串联序列互补的序列和与酶切末端一侧的核酸片段互补的序列。

21、优选地，所述特异性探针用于检测核酸片段样品中是否含有特异性内切酶识别的位点。

22、优选地，所述特异性探针含有与核酸片段上特异性内切酶识别的位点互补配对的序列。

23、优选地，所述特异性探针包括taqman探针、mgb探针、双杂交探针、分子信标探针或蝎形探针中任意一种或至少两种的组合。

24、优选地，所述特异性探针的5’末端携带荧光基团，3’端携带淬灭基团。

25、优选地，所述荧光基团包括fam、tet、vic、rox、cy5或hex中任意一种或至少两种的组合。

26、优选地，所述淬灭基团包括tamra、bhq或dabcyl。

27、优选地，所述对扩增检测模板进行检测采用的扩增引物包括引物一和引物二；所述引物一特异性结合扩增检测模板中的被检测序列，所述引物二特异性结合所述茎环序列。

28、优选地，所述茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法包括：

29、(1)采用识别特异性位点的内切酶识别含有被检测序列的双链核酸片段，所述含有被检测序列的双链核酸片段中含有特定酶切位点，酶切后形成含有特定酶切末端的双链片段；所述特定酶切末端的3’端或5’端序列明确；

30、所述酶切反应条件为：30±2℃孵育0.5-1.5小时；

31、(2)加入茎环结构的dna片段，捕获所述含有特定酶切末端的双链片段；所述茎环结构的dna片段从5’到3’由第二串联序列、茎环序列、第一串联序列和结合捕获序列依次连接得到；

32、所述第一串联序列与第二串联序列至少部分反向互补配对，折叠后形成茎环结构的dna片段；所述第二串联序列5’端进行磷酸化修饰，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对，捕获含有特定酶切位点的核酸片段；所述结合捕获序列还包括3’末端核酸延伸阻断修饰；

33、(3)采用dna连接酶将第二串联序列的5’末端与核酸片段的3’末端连接；

34、所述连接反应的反应程序为：95±2℃，30±2s；60±2℃，90±10s，8-12个循环；

35、(4)加入与茎环结构的dna片段的环形区互补配对的环形引物进行pcr扩增延伸，依次延伸至第二串联序列和切割后的核酸片段，得到扩增检测模板；

36、(5)采用特异性探针和扩增引物对扩增检测模板进行检测，所述特异性探针含有与核酸片段上特异性内切酶识别的位点互补配对的序列；对于含有特异性内切酶识别的位点的核酸片段样本有信号输出，否则无信号输出；

37、所述检测的反应体系中特异引物的终浓度为200-600nm，通用引物的终浓度为200-600nm，特异性探针的终浓度为100-400nm；

38、所述检测的pcr反应程序为：95±2℃预变性2±0.5min；95±2℃，10±2s，62±2℃，45±2s，40-45个循环。

39、第二方面，本发明提供一种茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法进行检测；所述特定位点包括识别甲基化的内切酶所特异识别的位点，以及snp上的特异性内切酶所特异识别的位点和基因突变的内切酶所特异识别的位点中任意一种或几种组合。

40、优选地，所述试剂盒还包括扩增试剂或检测试剂。

41、优选地，所述甲基化的内切酶选自abasi、aoxi、bisi、blsl、dpni、fspei、glai、glui、kroi、lpnpi、mali、mspji、mtei、pcsi、pkri或sgei中任意一种或几种组合。

42、第三方面，本发明提供第一方面所述的茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法在核酸检测中的应用。

43、优选地，所述应用包括：甲基化检测、snp的检测或其他基因突变检测。

44、第四方面，本发明提供一种甲基化检测试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法进行检测。

45、优选地，所述试剂盒包括甲基化内切酶、茎环结构的dna片段、环形引物或特异性探针中任意一种或至少两种的组合。

46、优选地，所述甲基化内切酶切割核酸片段后，获得含有特定酶切末端的双链片段。

47、优选地，所述茎环结构的dna片段从5’到3’由第二串联序列、茎环序列、第一串联序列和结合捕获序列依次连接得到。

48、优选地，所述第一串联序列与第二串联序列至少部分反向互补配对，折叠后形成茎环结构的dna片段。

49、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对，捕获含有特定的酶切末端的核酸片段。

50、优选地，所述结合捕获序列与切割后的核酸片段的3’末端互补配对后，采用dna连接酶将第二串联序列的5’末端与核酸片段的3’末端连接。

51、优选地，所述结合捕获序列还包括核酸延伸阻断修饰。

52、优选地，所述环形引物与茎环结构的dna片段的环形区互补配对。

53、优选地，所述环形引物从茎环结构的dna片段的环形区开始扩增，依次延伸至第二串联序列和切割后的核酸片段。

54、优选地，所述特异性探针含有与核酸片段上甲基化内切酶识别的位点互补配对的序列。

55、优选地，所述试剂盒还包括扩增试剂或检测试剂。

56、第五方面，本发明提供一种snp的检测试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法对snp位点进行检测。

57、第六方面，本发明提供一种基因突变检测试剂盒，所述试剂盒采用第一方面所述的茎环结构介导的用于检测核酸特定位点的方法对基因突变位点进行检测。

58、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

59、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

60、(1)本发明的方法可以缩短甲基化检测时间，将原来的十几个小时的检测时间缩短到3小时以内。

61、(2)本发明的方法可以提升单碱基突变检测特异性。

62、(3)本发明的方法可以检测低浓度突变核酸，提升模板检出的最低检测限，具有较高的灵敏度。

63、(4)本发明的方法可以适配微流控设备实现自动化。