猪圆环病毒3型Cap单克隆抗体及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物免疫，具体涉及一种猪圆环病毒3型cap单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,pcv3)为新发传染病病原，该病毒跟猪皮炎与肾病综合征以及繁殖障碍等的发生有密切关联。pcv3在一些养猪国家广泛发生与流行，严重危害猪群健康。

2、pcv3含有11个潜在的开放阅读框，主要编码orf1和orf2两个基因，其中orf1编码病毒复制相关蛋白，orf2编码病毒衣壳蛋白(cap蛋白)。cap蛋白是pcv3主要的免疫保护性抗原，表位是其发挥免疫保护的关键。

3、单克隆抗体是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，其可通过杂交瘤细胞技术制备，且纯度高、成本低、特异性强、高效、无残留，可用于相应疾病预防与治疗。

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5、b细胞克隆针对特定抗原决定簇产生的抗体，具有高度特异性和单一性的特点，称为单克隆抗体。1975年，单克隆抗体首次获得，通过小鼠的骨髓瘤细胞和经抗原刺激的小鼠b淋巴细胞融合后的杂交瘤细胞可以产生均一的特异性的抗体，这一技术被广泛应用研究。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，单克隆抗体在生命科学研究中发挥重要作用，被用于免疫检测和疾病的早期筛查。单抗的制备过程中，需要完整的步骤设计，包括抗原的选择，动物免疫、细胞融合、抗体鉴定和纯化等步骤，每个步骤都非常重要决定着单抗制备的成功与否。对于单克隆抗体的制备技术，现已有方法可以通过流式细胞术，在短时间内获得高亲和力的单抗。通过流式细胞术单细胞分选技术，将免疫小鼠或兔子的脾脏中获得igg记忆b细胞，通过荧光标记抗原，可以筛选到抗原特异性的b细胞，最后通过pcr扩增重链和轻链可变区基因，可以转染真核细胞进行抗体的重组表达。这项技术在单抗研发和制备上取得了巨大的进步，但操作复杂，技术要求较高，还未进行广泛的实验室应用，目前对于实验室操作，应用最简单方便的还是杂交瘤细胞融合技术。

6、在针对pcv单克隆抗体的研究中，已有很多报道。将pcv2 cap蛋白表达纯化后自组装成病毒样颗粒，以病毒样颗粒为免疫原免疫balb/c小鼠，获得两株单克隆抗体，效价均可达到1:656100，ifa和western blot试验均显示出单克隆抗体的特异性免疫反应，ihc检测结果也验证了单抗与pcv2临床样品的特异性反应。pcv3截短的cap蛋白进行原核表达，制备了8株单抗，均能与真核表达的cap蛋白产生特异性反应，3株单抗效价均在1:204800以上。对于最新的pcv4也有单抗研究的报道，利用pcold tf载体实现对pcv4 cap蛋白的高效可溶性表达，制备了2株单克隆抗体，可以与pcv4cap蛋白发生特异性反应。以上结果说明，单克隆抗体在pcv病毒上已有广泛研究，具有的重要意义和研究价值。

7、b淋巴细胞对抗原分子的识别通常只能识别一部分，被识别的区域称为抗原决定簇或抗原表位。抗原表位作为抗原分子的一部分，展现出免疫活性，体现在可与b细胞抗原受体及抗体分子发生相互作用。具体来说，抗体特异性通常指的是对其特定抗原表位的识别，而不是整个抗原分子。在免疫反应过程中，受到抗原刺激的b细胞，会分化并产生针对单一抗原表位的抗体，即单克隆抗体。单克隆抗体对于多克隆抗体来说，显示出极高的特异性，尤其在筛选和鉴定抗原表位方面，使得它们在抗原表位的识别和验证中成为关键工具。若单克隆抗体识别出的是中和性表位，则判定其为具有中和活性的抗体。表位疫苗的设计原理是利用精确的抗原表位激发特异性的体液免疫和细胞免疫反应，通过基因工程的操作手段，可以构建多个表位基因工程疫苗，实现对机体的高效保护性免疫。利用高度保守的中和表位来研究高度变异的病毒疫苗，可以防止因病毒变异而造成的免疫失败。在对疫病的诊断中，依赖于高度保守的和串联的表位开发的诊断技术表现出高敏感性和特异性。对于抗原表位的深入分析不仅有助于揭示抗原的结构与功能、相关的免疫反应的信息，还对表位疫苗的研发和诊断技术的建立具有指导性的意义。

8、pcv3 cap是病毒的主要结构蛋白，在病毒介导机体产生抗体的过程中发挥重要作用。因此，cap蛋白在pcv3基因工程疫苗和诊断技术研究中发挥不可或缺的功能。对于pcv3cap蛋白的抗原表位，已有预测潜在的线性b细胞表位位于氨基酸区域5-26、34-43、42-61、71-81、95-105、114-159、161-166、169-175、170-181、191-204，在氨基酸29-38、101-109、113-121、172-180和201-210处预测了t细胞表位，但对于cap蛋白的表位鉴定工作，还有待进一步研究。57nkpwh61、140khsryft 146和161qslfff166三个抗原表位已经被鉴定为pcv3 cap蛋白的抗原表位；55qnnkpw60被鉴定是cap蛋白的一个核心b细胞抗原表位，并在小鼠免疫试验中反向验证了表位所在多肽可以诱导小鼠产生与pcv3 cap蛋白的抗体；线性b细胞表位131-143aa为最近鉴定的pcv3 cap蛋白抗原表位，通过与vlps的反应验证了该表位存在的真实性。

9、本技术以制备的全长cap蛋白为基础，免疫babl/c小鼠制备pcv3的单克隆抗体，为pcv3 cap蛋白抗原表位的研究和pcv3血清学诊断方法的开发提供有效的生物材料，为pcv3的分离鉴定和致病机理的研究奠定基础；利用获得的单克隆抗体，通过肽扫描法鉴定pcv3cap对应的抗原表位，并分析筛选表位的免疫原性，以期为pcv3cap蛋白的结构和功能研究、表位疫苗的研发及诊断提供科学依据。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，得到有效防控pcv3的单克隆抗体。

2、本发明采用的技术方案为：一种猪圆环病毒3型cap单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链为igg2b型，轻链为κ链。

3、猪圆环病毒3型cap单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

4、以his-cap重组蛋白制备免疫抗原；

5、使用免疫抗原免疫小鼠；

6、融合小鼠的免疫脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；

7、对杂交瘤细胞的上清液进行特异性筛选，用建立的间接elisa方法筛选阳性孔，3天后再重复检测一次，两次结果都是阳性的孔被选择出来，获得单克隆抗体杂交瘤细胞株；

8、将单克隆抗体杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔得到单克隆抗体。

9、猪圆环病毒3型cap单克隆抗体的应用，利用猪圆环病毒3型cap单克隆抗体，通过肽扫描法鉴定pcv3 cap蛋白对应的抗原表位，并分析筛选表位的免疫原性。

10、进一步地，通过肽扫描法鉴定pcv3 cap蛋白对应的抗原表位，具体包括以下步骤：

11、抗原表位的预测：用dnastar和抗原表位预测网站对pcv3 cap蛋白基因序列的结构、理化性质和抗原性等信息进行预测分析，预测抗原表位所在的位置，对抗原表位进行预测，确定表位的截短策略；

12、引物的设计与合成：根据基因序列，分段设计特异性引物，在引物上下游引入酶切位点bamh i和xhoⅰ，用双酶切的方式构建表达截短蛋白的重组表达质粒；

13、截短蛋白表达载体的构建：以pgex-4t-1为构建截短肽的载体，以pgex-4t-1-cap质粒为模板，用设计的上述引物对各个截短肽片段进行pcr扩增，通过双酶切酶连的方式构建原核表达重组质粒，构建的质粒进行pcr鉴定并测序，测序无误的质粒进行下一步的表达；

14、截短蛋白的表达：构建重组表达质粒pgex-4t-1-n，在bl21感受态中进行诱导表达，并通过western blot将表达的截短蛋白与gst标签抗体进行免疫印迹分析；

15、抗原表位的初步鉴定：根据抗原表位的预测结果，首先将pcv3 cap蛋白全长基因截短成4段n1-n4，根据截短蛋白与单克隆抗体的反应情况，进一步将被定位的肽段继续截短成重叠片段，将表位区间不断缩小，最后通过将表位短肽从n端和c端逐个缩短的方式来对抗原表位进行最终定位；表位筛选鉴定过程中，采用将截短蛋白作为包被抗原的肽段elisa方法和斑点免疫印迹的方法对单克隆抗体识别的抗原表位进行鉴定；

16、抗原表位的精确定位：在确定最终抗原表位后，将短肽两端氨基酸缺失，精确单克隆抗体识别cap蛋白的最小表位序列，筛选过程同样用肽段elisa和dot blot方法进行鉴定。

17、优选地，所述引物序列为：

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20、优选地，所述分析筛选表位的免疫原性，具体为：

21、保守性分析：为评估单克隆抗体识别的pcv3 cap蛋白最小表位的保守性，从genbank中随机选取不同pcv3病毒序列，在上述序列中分析比对鉴定的抗原表位区域，分析鉴定抗原表位的保守性；

22、生物学信息分析：对pcv3 cap蛋白三维结构进行模拟，分析研究抗原表位在立体结构中的位置，鉴定的抗原表位的生物学信息；

23、抗原表位的免疫原性鉴定：为鉴定筛选的抗原表位的免疫原性，将表位短肽与血蓝klh蛋白进行偶联并合成，将klh-表位短肽用弗氏佐剂乳化，采用皮下注射的方式免疫balb/c小鼠，共免疫三次，隔14天免疫一次，第三次免疫后的第三天采集小鼠血清，将免疫小鼠血清进行western blot和ifa分析，验证表位短肽的免疫原性。

24、本发明获得的有益效果为：本发明制备的单克隆抗体具有较高的血清效价，经western blot和ifa鉴定单克隆抗体与cap蛋白具有良好的反应活性；通过肽段扫描法鉴定了单抗7e3识别的pcv3 cap蛋白的新型线性抗原表位为110dldgaw115。抗原表位110dldgaw115在pcv3序列中高度保守，表位短肽110dldgaw115免疫小鼠后可以诱导小鼠产生针对全长cap蛋白的抗体，筛选的新型抗原表位具有良好的免疫原性。