一种利用海洋低温蛋白酶规模提取小分子PDRN的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种利用海洋低温蛋白酶规模提取小分子pdrn的方法。

背景技术：

1、多聚脱氧核糖核苷酸（pdrn，poly deoxy ribo nucleotide）是主要从鲑鱼生殖细胞中提取的特定规格的dna片段。该成分中的dna碎片与人体构成最为接近，可促进人体细胞再生，促进伤口恢复，同时能够减少疤痕生成，也可减轻痛症。pdrn取自鲑鱼精巢，通过提纯和高温杀菌等提取工艺获得，可确保pdrn含量和活性成分纯度，且不含任何药理性蛋白和多肽，从而保证了产品的高安全性。

2、中国专利申请cn113105515a公开了一种从鲑鱼精液中分离脱氧核苷酸的方法，该方法分离出的脱氧核苷酸纯度较高，且便于操作，但最终的产物得率较低；cn107287186a公开了一种从鱼类精液分离pdrn的方法，但该方法获得的产物纯度较低，实际操作时，产率也不高，有进一步优化空间；cn110747194a公开了一种小分子多聚脱氧核糖核苷酸及其制备与应用，其分子量主要集中于50bp-1000bp，但采用90～100°c恒温水浴，高温反应条件易发生美拉德反应导致产品颜色变黄；cn112315836a公开了一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用，虽然避免了美拉德反应但反应时间较长，且pdrn的分子量较大。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用海洋低温蛋白酶规模提取小分子pdrn的方法，该方法利用海洋低温生物酶结合枯草杆菌蛋白酶和胰蛋白酶作为组合酶在较低温度下可实现pdrn的快速裂解且制备的pdrn分子量更小，时间更短。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用海洋低温蛋白酶规模提取小分子pdrn的方法，用于提取该小分子pdrn的原料为鲑鱼精巢。具体包括以下步骤：

3、（1）生物样品进行精洗，加入8倍体积的预处理液匀浆；

4、（2）在步骤（1）所得匀浆液中加入 4%的复合酶解液，27℃酶解 6h；

5、（3）在步骤（2）所得的酶解液中加入 1%的表面活性剂，0.5%的螯合剂，600rpm 混合 2h，过滤得上清液；

6、（4）在步骤（3）所得的上清液中加入 dna 裂解液，55℃裂解 30 min

7、得到裂解液；

8、（5）在步骤（4）所得的裂解液中加入3倍体积 4℃预冷的沉淀液，-20℃静置3h，过滤弃上清，收集沉淀；

9、（6）将步骤（5）收集的沉淀冷冻干燥，得到小分子pdrn片段。

10、优选的，所提取的小分子pdrn中分子量为50-1000bp的dna片段占总质量的90-99%。

11、优选的，所述海洋低温蛋白酶为单环刺螠低温蛋白酶。

12、优选的，所述复合酶解液的质量比为单环刺螠低温蛋白酶：枯草杆菌蛋白酶：胰蛋白酶=3:2:5。

13、优选的，所述单环刺螠低温蛋白酶的制备方法如下：

14、（1）蛋白酶基因工程菌株的构建：根据蛋白酶clp基因序列，以pmd19-t-clp为模板，设计引物f（序列1）、r（序列2），使用pcr技术进行蛋白酶基因的扩增，回收pcr产物并连接载体pmd19-t simple，将该质粒转化大肠杆菌dh5α，得到重组质粒命名为pmd19-t-clpsimple，用ecori 与noti同时酶切质粒pmd19-t- clp simple和载体ppic9k，37℃酶切2~4h，加入 4μl 10xloading buffer终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳，并回收酶切片断，将酶切片断与载体进行连接，构建好的表达载体命名为ppic9k-clp，16℃过夜，将连接体系转化大肠杆菌dh5α，并涂于含卡娜霉素的平板上，挑选阳性克隆，提取的质粒用bg1 ii 线性化酶切质粒，使用核酸回收试剂盒回收产物；

15、（2）蛋白酶的发酵制备方法：将重组菌株接入到装有100mlbmgy液体培养基的1 l摇瓶中，250-300 rpm，28℃培养至od600=2-6；3000-4000 g离心5-8min，弃上清，收集细胞；将菌液沉淀重新悬浮后转移到20ml bmmy液体培养基中，使用100ml摇瓶，保证一定的通气量，28℃继续培养。每隔24 h在培养基中加入100%甲醇至终浓度为0.5%；培养54h后，3000-4000 g离心5-8min，取上清；测试上清中酶的活力，超过500u/ml即可收集。

16、优选的，利用单环刺螠低温蛋白酶规模提取小分子pdrn的具体方法为：

17、（1）配置预处理液：每 100ml预处理液中含有 1.5g氯化钠，1.6g 柠檬酸钠，0.5g枸橼酸钠，0.5g青霉素，1g链霉素；

18、（2）取鲑鱼精子5kg，加入 40kg 预处理液，匀浆处理 2h；

19、（3）过滤：用18目孔径过滤匀浆液，去除小粒径组织；

20、（4）过滤后的鱼精浆液加入 4%的复合酶，27℃酶解 6h；

21、（5）在所得酶解液中加入 1%的表面活性剂，0.5%的 edta 600rpm 混合 2h；

22、（6）过滤：将酶解液过滤，分别经过 60μm、10μm 两级粗滤，再经过1μm、0.45 μm、0.22μm 三级精滤得上清液；

23、（7）裂解：将上清液中加入裂解液,55℃裂解 30 min；

24、（8）浓缩：将所得裂解液进行真空减压浓缩，得到浓缩液；

25、（9）沉淀：将浓缩液加入到 4℃预冷的沉淀液异丙醇中，-20℃静置1h，35 目过滤收集沉淀和上清；

26、（10）再沉淀：将上清液再次加入到4℃预冷的沉淀液乙醇中，-20℃静置 3h，18目过滤收集沉淀；

27、（11）清洗：将得到的沉淀在 60%的乙醇中进行清洗，去除盐类、多糖、异丙醇等物质；

28、（12）冻干：冷冻干燥，得到小分子pdrn。

29、其中，所述步骤（1）中的f（序列1）、r（序列2）的基因序列为

30、f 5’-gacgaattcgcaggcgtgtctcaagg -3’ 下划线为ecori 酶切位点；

31、r 5’-aacgcggccgcgttctcaacttgtgggg-3’ 下划线为noti 酶切位点。

32、蛋白酶基因的pcr扩增反应条件为预变性94℃，5min;变性温度，94℃，1min；退火温度，63℃，1min；延伸温度72℃，1.5min；32个循环后，72℃，延伸10min。

33、反应体系(50μl)包括：10× buffer 5.0μl ；dntps(2.5 mm) 4.0μl ；f5 (50 mm)1.0 μl ；r5 (50 mm) 1.0 μl ；taq dna polymerase 0.5μl 。

34、酶切体系(20μl): pmd19-t- clp simple / ppic9k 10μl；10×m buffer 2 μl ；ecori 1 μl；noti 1 μl；双蒸水 6 μl。

35、连接反应体系(10μl): ppic9k 2 μl ；目的片断 2μl ；t4 dna ligase 1 μl ；10×t4 dna ligase buffer 1 μl；双蒸水 4μl。

36、步骤（2）中的bg1 ii 线性化酶酶切体系(20μl)：ppic9k-clp 10 μl；10×hbuffer 2 μl；bgl ii 1 μl；双蒸水6 μl。

37、步骤（5）中所述的表面活性剂为sds:吐温80=4:6的质量比复合；步骤（7）中所述的dna裂解液为 15mm nac1、10mm edta、0.4%sds、20μ g/ml 蛋白酶k。

38、优选的，所述pcr产物为一条1100bp左右的片段；线性化处理后的ppic9k-clp，大小约为11.0k；ppic9k-clp上清蛋白酶活力为2000u/ml。

39、与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）解决了现有技术中pdrn提取反应温度较高，易发生美拉德反应的问题；（2）利用新研发的单环刺螠低温蛋白酶进行pdrn提取中的酶解反应，反应温度更低，酶解时间更短；（3）采用该方法制备的pdrn分子量控制在10kd以内，且收率提升了4-5倍，纯度更佳。