本技术属于生物，涉及一种rsv pre-f突变体及其生产方法和用途。
背景技术：
：：1、人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是一种常见的呼吸道病毒，属于病毒科下的单链rna病毒，它是导致世界范围内婴幼儿和年幼儿童呼吸道感染的主要病原体之一。rsv最常见的流行季节是秋冬季，尤其在幼儿之间传播最为频繁。rsv感染可引起呼吸道病症，包括感冒症状、喉咙痛、咳嗽、打喷嚏、鼻塞和发热。在婴幼儿和免疫系统较弱的人群中，rsv可能导致严重的下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。2、在过去的几十年中，许多rsv疫苗候选物已经进行了临床试验，包括减毒病毒疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等。然而，由于复杂的rsv病毒特性和免疫学反应，这些疫苗的开发面临了一些挑战，包括无法获得持久的保护性免疫应答，以及对儿童和老年人等高危人群的有效性可能不足。3、尽管如此，科学家和制药公司仍在不断努力，试图寻找到更有效的rsv疫苗。一些研究团队正在专注于了解rsv病毒的免疫学特性，以及如何激发持久性和全面性的免疫反应。同时，一些新的技术平台和策略也在疫苗研发中被尝试，如微粒化疫苗、纳米粒子疫苗和结构特定抗原的设计等。4、f蛋白属于i型糖蛋白。在细胞内合成无活性的前体f0，在成熟的过程中，f0由弗林酶切割形成f2(aa:1-109)、p27(aa:110-136)和f1(aa:137-574)，f2与f1以二硫键形成异源二聚体即f蛋白的单体，三个单体组装形成三聚体。f蛋白采用亚稳态的融合前f蛋白(pre-fusion protein，pre-f)表达在病毒包膜表面，当与宿主细胞膜接触后，f1蛋白n末端的二级结构组件α2、α3及β3、β4和α4经过一系列重排后与其后的α5一同形成了一个更大的α螺旋结构，该系列过程导致了f蛋白由高能级亚稳态的pre-f结构转变为稳定的融合后f蛋白(post-fusion protein，post-f)结构，相较于post-f，研究表明，绝大多数高效中和抗体靶向表位仅在pre-f，存在于pre-f单体顶端的抗原表位和pre-f三聚体顶端的抗原表位v被证明具有极强的效力。因此pre-f作为靶抗原已成为rsv疫苗的优先选择。5、目前rsv疫苗研发方向是寻找构象更稳定的rsv pre-f突变体。基于蛋白质结构和稳定性原理进行设计，ds-cav1突变体通过空腔填充突变(s190f和v207l)和二硫键替换(s155c和s290c)，将不稳定的f1蛋白n末端固定从而获得稳定且具抗原表位的pre-f蛋白(mclellan等，science，2013)。美国国立卫生研究院(nih)基于结构设计的迭代突变体也展示出了稳定的融合前构象(pct/us2014/026714家族)，辉瑞公司(pfizer)公开发明的rsv f蛋白突变体(cn 108738312a)设计突变位的策略也大致相似，二硫键替换除s155c和s290c外还有s55c和l188c、t103c和i148c以及l142c和n371c；空腔填充包括190位置被i取代，54位置被h取代等；增加静电突变d486s、e487q等，同时进行不同的组合突变体。janssen设计的sc-dm(anders krarup等，nature commnication，2015)是将弗林酶切割位点及p27删除并替换为gs linker和引入突变n67i和s215p以维持蛋白稳定，最后运用t4噬菌体纤维蛋白三聚结构域使蛋白分泌表达并形成三聚体；而gsk的pre-f-gcn4t(normand blais等，journal of virology，2017)将f0蛋白的跨膜结构域和c-末端结构域被工程化的酿酒酵母gcn4三聚化结构域取代；弗林酶切割位点和p27序列被去除，在f2和融合肽(fp)之间的该位置保留一个赖氨酸残基；增加了突变l112q、q471g和l482k以增加蛋白质的均一性和稳定性，并被证明可结合表位特异性单克隆抗体d25。6、有上述表述可见，以rsv f蛋白结构为基础，基于不同的设计策略，衍生了多个位点的突变，这些突变均能够阻止rsv f蛋白向post-f蛋白的构象变化，使rsv f蛋白稳定在融合前构象(pre-f)。然而，为了寻找更加稳定的rsv pre-f蛋白构象，目前的研究仍是不充分的，pre-f蛋白的表达量和稳定性仍有提升的空间。因此，新的探索和尝试仍在努力尝试中。7、2013年，通过抗体d25发现表位并命名为位点[mclellan,jason s.,et al."structure of rsv fusion glycoprotein trimer bound to a prefusion-specificneutralizing antibody."science 340.6136(2013):1113-1117.]，为解决在缺乏d25抗体，位点的不稳定问题，进一步改造获得工程化的稳定的rsv f蛋白融合前构象(pre-f)抗原[mclellan,jason s.,et al."structure-based design of a fusion glycoproteinvaccine for respiratory syncytial virus."science 342.6158(2013):592-598.]，主要涉及二硫键突变：ds(s155c、s290c)、空腔填充：cav1(s190f、v207l)及突变组合ds-cav1，也包括由其衍生的其他突变体(pct/us2014/026714家族)。8、2015年，janssen pharmaceutical发表了其构建的稳定化的pre-f蛋白突变体的研究证据，在f1和f2间引入短链linker，变体结合纤维蛋白结构域后进行氨基酸突变改造获得sc-dm及sc-tm[krarup,anders,et al."a highly stable prefusion rsv f vaccinederived from structural analysis of the fusion mechanism."naturecommunications 6.1(2015):8143.]，涉及的氨基酸突变包括：sc-dm(n67i，s215p)、sc-tm(n67i，s215p，e487q)(us_11338031_b2家族)。9、gsk公司在ds-cavl的基础上进行二次开发(us8563002)，重点对弗林蛋白酶酶切割位点和蛋白c端三聚化进行了保护和约束。鉴于其良好的免疫原性和诱导中和抗体的能力，gsk于2022年宣布其rsv疫苗针对60岁以上成人iii期临床取得积极结果，并于2023年05月03日获得上市许可(商品名：arexvy)也是第一个针对rsv病毒的疫苗。10、pfizer基于其结构设计的稳定化的pre-f蛋白突变体(pct/ib2016/057502家族)主要涉及的突变策略包括二硫键突变和空腔填充，涉及的二硫键突变位点包括：s55c/l188c、s155c/s290c、t103c/i148c、l142c/n371c,以及增强pre-f蛋白稳定性的其他空腔填充和静电突变位点。由于突变体良好的免疫原性和优良的疫苗效力，pfizer于2022年宣布其二价rsv疫苗iii期临床取得积极结果，在2023年5月获得上市许可(商品名：abrysvo)，成为继arexvy第二个针对rsv病毒的疫苗。11、目前针对稳定化的rsv pre-f蛋白主要是表达量低，长期保存不稳定。针对这一问题需要对rsv f蛋白进行结构设计，寻找更加稳定的突变策略。技术实现思路1、基于此，本技术一个或者多个实施例提供一种rsv pre-f突变体及其生产方法和用途。2、本技术的一个或者多个实施例提供一种rsv pre-f的突变体，所述突变体的f1多肽满足如下(1)或者(2)所示的条件：3、(1)β3片层区域具有半胱氨酸取代基β3-1，β4片层区域具有半胱氨酸取代基β4-1，所述半胱氨酸取代基β3-1和所述半胱氨酸取代基β4-1形成二硫键；4、(2)α3螺旋区域具有半胱氨酸取代基α3-1，β3片层区域具有半胱氨酸取代基β3-1和半胱氨酸取代基β3-2，β4片层具有半胱氨酸取代基β4-1，所述半胱氨酸取代基β3-1和所述半胱氨酸取代基β4-1形成二硫键，所述半胱氨酸取代基α3-1和所述半胱氨酸取代基β3-2形成二硫键；5、所述突变体具有以下半胱氨酸突变组合中的一组：6、组合1为s180c和s186c；以及，7、组合2为k176c和s190c。8、在本技术的一些实施方式中，所述rsv pre-f的突变体的物种来源为人或者牛。9、在本技术的一些实施方式中，所述rsv pre-f的f1多肽的氨基酸序列如seq idno.4、seq id no.71和seq id no.72中任一所示，或者与seq id no.4、seq id no.71和seqid no.72中任一所示的氨基酸序列所存在至少80％的同源性；10、可选地，所述f1多肽满足如下条件中的一个或者多个：11、(1)不含跨膜结构域，以及12、(2)不含胞内结构域；13、更进一步可选地，所述f1多肽具有如下突变中的一个或者多个：i379v和m447v。14、在本技术的一些实施方式中，所述突变体具有如下半胱氨酸突变组合中的一组：15、组合3为s180c、s186c、a170c、a177c；16、组合4为s180c、s186c、e163c、l181c；17、组合5为s180c、s186c、a170c、v179c；18、组合6为s180c、s186c、l171c、a177c；19、组合7为k176c、s190c、a170c、a177c；20、组合8为k176c、s190c、e163c、l181c；21、组合9为k176c、s190c、a170c、v179c；以及，22、组合10为k176c、s190c、l171c、a177c。23、在本技术的一些实施方式中，所述突变体还具有如下突变位点中的一个或者多个：s55c、s155c、v207l以及s290c。24、在本技术的一些实施方式中，所述突变体不含弗林蛋白酶切割位点片段。25、在本技术的一些实施方式中，所述突变体不含pep27多肽，f2多肽的c端和所述f1多肽的n端以酰胺键直接连接或者通过柔性短肽间接连接；26、可选地，所述柔性短肽为gs、g、s、gs、sg、ss、gg、pg、ggg、ggs、sss、gsg、sgs、gpg、gsgs、gggs、gpgs、gggg、gsgg、ggsg、sggg、gssg、sgsg、gssg、ggpgg或者ggggs。27、在本技术的一些实施方式中，所述突变体的f2多肽满足如下条件中的一个或者多个：28、1)c端不含有nn，以及，29、2)具有如下突变：p102a；30、在本技术的一些实施方式中，所述突变体的c末端连接有标签片段；可选地，所述标签片段包括多聚组氨酸；进一步可选地，所述多聚组氨酸包括8his片段。31、在本技术的一些实施方式中，所述突变体还包括结构性多肽和功能性多肽中的一种或者多种；所述结构性多肽使多个所述突变体的单体形成多聚体，所述功能性多肽增强所述突变体的生物学活性；32、可选地，所述结构性多肽包括聚集基序、gcn4亮氨酸拉链和纳米颗粒缀合片段中的一种或者多种；33、可选地，所述功能性多肽包括抗原特异性结合片段；34、可选地，所述结构性多肽和所述功能性多肽中的一种或者多种。35、在本技术的一些实施方式中，所述突变体的序列如seq id no.20、seq id no.25至seq id no.70任一所示。36、本技术的一个或者多个实施例提供一种核酸分子，其编码所述的突变体。37、本技术的一个或者多个实施例提供一种载体，其包括所述的核酸分子。38、本技术的一个或者多个实施例提供一种工程细胞，其表达所述的突变体，或者其包括所述的核酸分子或者所述的载体。39、本技术的一个或者多个实施例提供一种所述的突变体的生产方法，其包括如下步骤：40、培养所述的工程细胞，以及，从所得培养上清中分离出突变体。41、本技术的一个或者多个实施例提供一种免疫组合物，其包括所述的突变体、或者所述的核酸分子，以及免疫佐剂；42、可选地，所述免疫佐剂包括铝盐佐剂、表面活性剂、多聚核苷酸、脂多糖、脂质体、油乳佐剂中的一种或者多种。43、本技术的一个或者多个实施例提供一种所述的突变体在制备呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒中的应用。44、本技术的一个或者多个实施例提供一种呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒，其包括所述的突变体。45、本技术的一个或多个实施例细节在下面的描述中提出，本技术的其他特征、目的和优点将从说明书及其权利要求书变得明显。当前第1页12当前第1页12