NtSGS3a基因在调控PPO7和PPO8基因沉默效果中的应用和方法

本发明属于生物，涉及ppo基因沉默效果的调控，特别是指 ntsgs3a基因在调控 ppo7和 ppo8基因沉默效果中的应用和方法。

背景技术：

1、果蔬类在贮藏、加工等环节会受到褐变作用的影响，从而导致其经济价值下降、产品质量降低。多酚氧化酶存在与植物的组织中，是引起褐变作用发生的主要酶，烟叶中的ppo活性与烟叶调制、烟叶烘烤后的色泽、卷烟加工及其后期的贮藏都有重要的影响。目前国内外的大多数研究是通过控制ppo的活性来调控烟叶烘烤时的棕色化反应，以此来获得烟叶品质好的烟叶。

2、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，ppo）广泛存在于动植物当中，是一类由核基因编码的含有铜离子的氧化还原酶，它在植物的生理代谢、免疫反应、以及非生物胁迫等许多方面发挥着重要的作用，尤其是受到损伤后在有氧条件下，ppo可以催化酚类物质氧化从而促进自身愈合。多酚氧化酶基因在不同的植物中存在较大的差异，但大多数都是以基因家族的形式存在，有学者按照生物信息学方法明确了烟草基因组中 ppo基因家族的成员。目前关于烟草 ppo基因功能的研究主要集中在酶促棕色化反应方面，在有氧气存在的条件下，烟叶组织中所含有的ppo会在调制的过程中将烟叶内部所含有的酚类物质，例如：芸香苷、绿原酸等氧化成为醌类物质，其他酚类或蛋白质再于生成的醌类物质结合产生黑色素，从而使烟叶由黄色转变为不同程度的褐色，而烟叶内含的酚类物质又是多种香气物质的前体物。研究表明，当烟叶的颜色完全变为褐色时，烟叶内部中所含有的多酚类物质就会大幅度的减少，这不仅会对烟叶的外观品质产生影响，还会对烟叶中的芳香物质以及化学成分的含量产生影响，进而使烟叶的品质下降，经济价值降低。烟草ppo的活性调控大体上是通过抑制剂抑制、转基因抑制以及rna干扰技术去进行调控（公开号cn 117757818 a的）。

3、目前国内外利用vigs载体介导 ppo基因沉默从而降低ppo的活性，进而减少经过调制后的烟叶出现杂色或黑烟的情况，同时提高烤后烟叶中上等烟所占的比例，提高烟叶内部的香气物质含量，进而达到改善烟叶烘烤特性目标的研究已经取得较大的进展。但研究表明在高温条件下vigs介导的 ppo基因沉默的效果较差，无法显著降低其基因相对表达量和酶的活性。为了解决高温条件下依然能保持vigs介导 ppo基因沉默的影响效果。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种 ntsgs3a基因在调控 ppo7和 ppo8基因沉默效果中的应用和方法。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、 ntsgs3a基因在调控ppo基因沉默效果中的应用。

4、 ntsgs3a基因在调控高温胁迫下 ppo7和 ppo8基因沉默效果中的应用。

5、上述 ntsgs3a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、上述高温胁迫中高温为25-43℃。

7、上述高温胁迫中高温为25-40℃。

8、上述高温胁迫中高温为40℃。

9、进一步的，上述应用的对象为烟草。

10、利用 ntsgs3a基因缓解高温胁迫降低 ppo7和 ppo8基因沉默效果的方法，步骤为：构建 ntsgs3a基因的过表达载体，经农杆菌转化转入待处理烟草即可。

11、上述 ntsgs3a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

12、上述 ntsgs3a基因的过表达载体采用的引物序列为：

13、sgs3a-ecori-f（seq id no.2）：

14、agagaacacgggggactgaattcatgagttccagcaaagggg；

15、sgs3a-ecori-r（seq id no.3）：

16、gtcagatctacagccatctattcagattgctttgggg。

17、在引物序列中，划线部分所表示的就是酶切位点的位置。

18、上述待处理烟草为中烟100或k326。

19、本发明具有以下有益效果：

20、1、本试验在vigs体系再构建 ntsgs3a过表达载体，再经由农杆菌转化侵染中烟100后在不同的温度中进行处理，并测定不同温度处理下烟株的 ppo7和 ppo8基因的相对表达量与酶的活性，以此来探究 ntsgs3a基因能否缓解vigs介导的 ppo7和 ppo8基因沉默在高温胁迫下沉默效应消失的现象。结果表明：接种了含有过表达 ntsgs3a的vigs载体的烟株在40℃条件下依然可以保持降低烟叶中 ppo7和 ppo8的基因相对表达量，具有良好的沉默效果。但在43℃和46℃处理中，这种沉默效果并不明显；随着温度的升高，各个处理ppo的酶活变化并不明显，但有 ntsgs3a过表达载体的处理的酶活要低于其他处理，且处理间的差异随温度的升高减小。因此，在vigs体系中构建 ntsgs3a过表达载体为后续研究在高温条件下沉默 ppo基因提供了思路和方法。

21、2、试验通过vigs体系介导 ppo基因沉默的效率随着温度升高逐渐降低至消失，但加入了瞬时过表达 ntsgs3a的载体处理依然可以在较高温度40℃条件下依然保持对 ppo7和 ppo8基因的沉默效应，建立了基于病毒诱导的烟草 ppo沉默的较耐高温体系。该体系在40℃下依旧可以有效的沉默 ppo7和 ppo8，减少其基因相对表达量，通过降低其介导的酶促棕色化反应，有效提高了烟叶的品质。为后续的高温胁迫试验奠定了基础，提供了相关的实验思路与处理方法。