极地细菌抗冻蛋白优化改造方法与功能应用与流程

本公开涉及生物，尤其是涉及一种改造的细菌抗冻蛋白及其表达体系的构建。

背景技术：

1、抗冻蛋白（antifreeze proteins, afps）是一类能够在极端低温下保护生物体免受低温损伤的蛋白质，这类蛋白质最早是在南极冷水鱼中发现的，后来在昆虫、植物、微生物等多种生物体中均有发现。它们通过降低体液的冻结点，阻止冰晶的形成和生长，从而保护生物体在寒冷环境下的生存。抗冻蛋白在基因工程、低温生物医学等领域发挥着重要的作用，具有重要的社会效益和科研价值。抗冻蛋白种类多样，独立进化，抗冻蛋白在大小、活性、氨基酸组成和结构上有很大不同。最先被发现的鱼类抗冻蛋白主要被分为四类，其中i型鱼类抗冻蛋白具有最简单的结构，由单个富含丙氨酸（ala）的α螺旋组成，ii型鱼类抗冻蛋白通过二硫键稳定，而iii型鱼类抗冻蛋白主要通过疏水核心结合在一起。细菌抗冻蛋白（mpafp-riv）的冰结合区折叠成具有稳定的β-螺线管结构，昆虫抗冻蛋白一般富含苏氨酸（thr）组成多个重复序列形成β-折叠结构。虽然所有抗冻蛋白都具有相似的冰结合功能，但不同抗冻蛋白的基因序列和结构差异很大，因此归纳和观察相关研究内容很困难，唯一的共同点就是能和冰面结合并相互作用产生活性。不同结构的抗冻蛋白工作时，水分子围绕抗冻蛋白冰结合表面上的甲基基团形成有序结构，模拟靠近冰晶格的液态水分子（类冰水），使蛋白质吸附到冰晶表面上，抑制冰晶的生长和形成，保护生物体在低温环境下不受冻结损伤。在一些x射线晶体学研究中，观察到抗冻蛋白的冰结合位点上表面水组织，类似于冰晶格的液态层中水分子，而由于抗冻蛋白的冰结合位点的疏水性，从而限制存在的水量。目前尚不清楚表面类冰水具体机制，需要进行更多的功能研究来进一步了解这一过程。

2、天然抗冻蛋白通常来源于极端环境的生物中，数量和种类有限，而且性质和功能也有一定局限性。自然存在的抗冻蛋白的性质和功能都是由其基因决定的，而人工设计可以通过改变蛋白质的氨基酸序列和结构来优化其性质和功能，使其更适合于特定的应用需求。在人工设计抗冻蛋白的过程中，需要进行大量的实验验证和优化，同时还需要考虑其应用场景和安全性等问题。这是一个复杂而有挑战的领域，需要跨学科的合作和持续的努力。尽管人工设计抗冻蛋白是一个较新的研究领域，但其在未来的应用前景和产业化发展上具有很大潜力。因此，加强对人工设计抗冻蛋白的研究和开发，对于促进实际应用场景中的技术创新具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的发明目的是提供一种改造的、细菌来源的抗冻蛋白及其高效表达体系，通过人工设计和基因工程技术，旨在实现对天然抗冻蛋白功能的模拟与优化，以及增强其在低温环境中的保护效果并扩大其应用范围。具体地，本发明以天然细菌来源抗冻蛋白maafp为研究对象，人工设计改造的抗冻蛋白，并实现了天然抗冻蛋白和改造后的抗冻蛋白高效的异源表达。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供一种抗冻蛋白，所述抗冻蛋白为基于seq idno：1所示氨基酸序列的修饰序列。

3、在一个实施方案中，所述修饰序列为在seq id no：1所示氨基酸序列中插入一个或多个能够形成β-螺旋结构的氨基酸序列。

4、在一个实施方案中，所述能够形成β-螺旋结构的氨基酸序列包含seq id no：23或seq id no：24所示氨基酸序列。

5、在一个实施方案中，所述能够形成β-螺旋结构的氨基酸序列包含与seq id no：23或seq id no：24所示氨基酸序列具有至少大于90%、95％、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。

6、在一个实施方案中，所述能够形成β-螺旋结构的氨基酸序列是如seq id no：23或seq id no：24所示的氨基酸序列。

7、在一个实施方案中，所述修饰序列为在seq id no：1所示氨基酸序列中插入1个或2个所述能够形成β-螺旋结构的氨基酸序列。

8、在一个实施方案中，所述抗冻蛋白进一步包括荧光蛋白部分。

9、在一个实施方案中，所述抗冻蛋白的氨基酸序列包含seq id no：3、4所示氨基酸序列。

10、在一个实施方案中，所述抗冻蛋白的氨基酸序列包含与seq id no：3、4所示氨基酸序列具有至少大于90%、95％、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的氨基酸序列。

11、在一个实施方案中，所述抗冻蛋白的氨基酸序列是如seq id no：3、4所示的氨基酸序列。

12、本发明的另一个方面，还提供了编码根据前述任一种抗冻蛋白的核酸分子，或与其具有至少大于90％、95％、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的核酸分子。

13、在一个实施方案中，所述核酸分子包含选自seq id no:2、5、6、7、8、9、10、11、12所示的核苷酸序列。

14、在一个实施方案中，所述核酸分子包含与seq id no:2、5、6、7、8、9、10、11、12所示核苷酸序列具有至少大于90％、95％、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的核酸分子。

15、本发明的另一个方面，还提供了含有前述任一种核酸的载体。

16、在一个实施方案中，所述载体为质粒。

17、在一个实施方案中，所述载体为毕赤酵母表达载体和/或大肠杆菌表达载体。

18、在一个实施方案中，所述毕赤酵母表达载体为毕赤酵母质粒ppic9k、ppiczαa中的一种或多种。

19、在一个实施方案中，所述大肠杆菌表达载体为大肠杆菌质粒pet28a、pet28b中的一种或多种。

20、本发明的另一个方面，还提供了含有前述任一种抗冻蛋白、前述任一种核酸分子、或前述任一种载体的细胞。

21、本发明的另一个方面，还提供了含有前述任一种抗冻蛋白、前述任一种核酸分子、前述任一种载体，或前述任一种细胞的组合物或试剂盒。

22、在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒是低温细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒。

23、在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒中含有100-200µg/ml所述抗冻蛋白。

24、在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒中含有100µg/ml或200µg/ml所述抗冻蛋白。

25、在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒中还含有一种或多种另外的低温细胞保护剂。

26、在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒中还包括dmso。

27、在一个实施方案中，所述组合物或试剂盒中还包括dmso，且所述dmso在所述组合物或试剂盒中的浓度为5-10%，优选5%；

28、在一个实施方案中，所述低温细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒是-20℃和/或-80℃低温冻存细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒。

29、在一个实施方案中，所述低温细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒是-20℃和/或-80℃酵母菌低温冻存细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒。

30、在一个实施方案中，所述低温细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒是-20℃酵母菌低温冻存细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒。

31、在一个实施方案中，所述低温细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒是-20℃和/或-80℃小鼠胚胎成纤维细胞低温冻存细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒。

32、在一个实施方案中，所述低温细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒是-80℃小鼠胚胎成纤维细胞低温冻存细胞保护组合物或低温细胞保护试剂盒。

33、本发明的另一个方面，还提供了一种诱导表达前述任一种抗冻蛋白的方法，所述方法包括：构建编码根据前述抗冻蛋白的核酸分子的载体、转化受体细胞、筛选抗冻蛋白阳性克隆作为重组细胞、并对重组细胞进行诱导表达的步骤。

34、在一个实施方案中，所述对重组细胞进行诱导表达时的诱导表达温度为15-30℃，优选25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。

35、在一个实施方案中，所述对重组细胞进行诱导表达时的诱导表达时间为6-24h，优选7-9h。

36、在一个实施方案中，所述对重组细胞进行诱导表达时的诱导表达时间可以是5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h，优选8h。

37、在一个实施方案中，所述对重组细胞进行诱导表达时使用的诱导剂浓度为0.5-1mm，优选0.4-0.6mm。

38、在一个实施方案中，所述对重组细胞进行诱导表达时使用的诱导剂浓度为0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1 mm优选0.5mm。

39、在一个实施方案中，所述载体为质粒；优选地，所述载体为毕赤酵母表达载体和/或大肠杆菌表达载体；优选地，所述毕赤酵母表达载体为毕赤酵母质粒ppic9k、ppiczαa中的一种或多种；优选地，所述大肠杆菌表达载体选自大肠杆菌质粒pet28a、pet28b中的一种或多种。

40、本发明取得的有益效果为：

41、1）抗冻蛋白的设计与改造

42、基因序列优化：针对特定的宿主表达系统（如大肠杆菌、毕赤酵母等），对天然细菌来源抗冻蛋白maafp的基因序列进行优化，通过改变氨基酸序列和引入新的功能性结构域（如β-螺旋结构），设计出两种改造的抗冻蛋白afpa1和afpa2，以提高其在异源宿主中的表达量和抗冻活性。

43、表达载体构建：构建适合于大肠杆菌和毕赤酵母等表达系统的载体，引入特定的启动子、信号序列和标签（如his标签），以便于蛋白的表达、分泌和后续的纯化操作。

44、2）高效表达体系的构建

45、宿主选择与优化：选择适合于高效表达改造抗冻蛋白的微生物宿主，通过对培养条件、诱导策略和表达参数（如温度、诱导剂浓度、表达时间等）的优化，实现对改造抗冻蛋白的大规模生产。

46、表达后处理与纯化：开发高效的蛋白纯化和后处理技术，包括利用亲和层析、超滤和离心等方法，从宿主细胞中纯化出高纯度、高活性的改造抗冻蛋白，满足后续应用的需要。

47、3）改造抗冻蛋白的应用研究

48、低温保护效果评估：通过体外和体内的实验模型，评估改造抗冻蛋白在不同低温条件下对细胞、组织和生物样本的保护效果，包括抗冻活性测试、细胞存活率分析和组织结构的观察等。特别地，本发明发明人设计的两种改造后的抗冻蛋白afpa1、afpa2，实现了天然抗冻蛋白maafp和两种人工设计抗冻蛋白afpa1、afpa2的高效异源表达，并测定和分析了抗冻蛋白afpa1、afpa2的抗冻活性，特别是-20℃低温保存效果、以及对小鼠胚胎成纤维细胞低温保存效果，优于天然抗冻蛋白maafp。

49、4）潜在应用领域探索：探索改造抗冻蛋白在食品保鲜、医药保存、低温医学和农业耐寒改良等领域的应用潜力，通过与行业合作伙伴的合作，推动其工业化应用和商业化开发。

50、总之，本发明不仅提供了一种新型的改造抗冻蛋白及其表达体系，还为深入理解抗冻蛋白的作用机制和拓展其应用范围提供了新的思路和工具，有望在生物学研究和相关产业领域产生重要的社会和经济效益。这些研究有利于丰富抗冻蛋白作用机制内容和实际应用，实现了人工设计抗冻蛋白对天然抗冻蛋白maafp的替代，有望为抗冻技术的开发和特定应用提供更多的选择和可能性。