一种微重力环境培养癌细胞用培养基和相关试剂及其应用

本技术涉及一种微重力环境培养癌细胞用培养基和相关试剂及其应用，属于生物。

背景技术：

1、癌症是影响人民健康的重大疾病，因此探寻有效的癌症治疗策略、提高癌症治疗效果、延长患者生存时间对于全面推进健康中国建设具有关键意义。化疗和靶向治疗仍是目前乳腺癌系统治疗的主要手段。但是，由于患者的个体差异以及肿瘤本身的异质性，不同乳腺癌患者对化疗药物/靶向药物的反应千差万别，同一患者在治疗的不同阶段对化疗药物/靶向药物的反应也存在较大差异，最终导致部分患者无效用药。无效用药不仅严重影响乳腺癌的治疗效果，而且给患者带来巨大的身体损伤和经济负担。因此，针对个体患者的精准治疗已成为乳腺癌治疗的发展方向：通过针对每个患者制定个体化给药方案，实现医源性损害最小化、医疗耗费最低化以及病患获益最大化的目标。

2、因此使用肿瘤模型来测试用药的效果，就成为临床用药中经常需要参考的依据。

3、肿瘤细胞系是最早出现也是最为成熟的肿瘤模型，其易操作、成本低、实验结果可重复性高的特点使其成为过去几十年来肿瘤研究的支柱。但是长期体外培养导致其在肿瘤异质性和肿瘤微环境等方面与原始肿瘤组织产生巨大差异，且其缺少正常癌旁对照，因此在药物筛选实验中具有很大局限性。

4、患者来源的原代肿瘤细胞具有肿瘤细胞系易操作、成本低的特点，同时在一定程度上保留了患者肿瘤异质性特征。但是其培养成功率低且增殖能力不足，无法进行长期扩增，阻碍了原代肿瘤细胞在乳腺癌体外研究中的应用。

5、3d肿瘤类器官保留了原始肿瘤异质性，同时模拟了肿瘤细胞-细胞外基质的相互作用。但是不同患者来源的类器官培养时间存在较大差异，一定程度上影响了临床治疗决策的提出，并且类器官无法模拟成纤维细胞等间质细胞与肿瘤细胞的相互作用，同时其培养成本远高于前两种模型。

6、患者来源的异种移植瘤 (patient-derived xenograft，pdx) 模型弥补了3d肿瘤类器官无法模拟肿瘤与间质细胞相互作用这一缺点，较好的保持了肿瘤异质性。但是在培养过程中，患者来源肿瘤组织中的成纤维细胞逐渐被替换成小鼠成纤维细胞，导致pdx模型在结构和功能上与原肿瘤组织产生差异。另外，构建周期较长，成本较为昂贵也是其不足之处。

7、crc模型将铯源γ射线辐照过的swiss-3t3-j2小鼠胚胎成纤维细胞与人肿瘤细胞或正常细胞共培养，通过添加rock抑制剂y-27632，使患者来源的原代细胞获得部分干细胞特性和体外无限复制能力。该技术既保留了肿瘤细胞系培养易操作、成本低的优势，又保证了crc与原肿瘤组织的高度一致性及药敏特征，同时很好的模拟了肿瘤细胞与成纤维细胞的相互作用。更为重要的是，与pdx模型相比，在合适的培养条件下，该技术能够在短期内获得大量肿瘤细胞，满足临床上针对每个患者制定个体化给药方案的需求。另外，使用该技术培养的癌旁组织细胞也可以用于药物副作用的预测，从而为临床决策同时提供药物有效性和安全性两方面的预测结果。

8、尽管crc细胞培养技术在未来的癌症研究和临床治疗中具有广泛的应用前景，但是目前该技术仍存在诸多技术问题与限制。在理论层面，肿瘤细胞发生重编程的分子机制尚不明确；在技术层面，肿瘤细胞重编程过程高度依赖于小鼠胚胎成纤维细胞与rock抑制剂，而上述因素可能对肿瘤细胞增殖、侵袭、凋亡及药物敏感性产生较大影响，从而影响crc细胞作为肿瘤模型在癌症研究中的准确性。

9、肿瘤细胞群体中包含一小部分具有自我更新能力和无限增殖潜能的细胞，即肿瘤干细胞 (cancer stem cell，csc)。肿瘤干细胞的存在与干性维持对患者来源原代肿瘤细胞的成功培养至关重要。对此发明人研究发现：特定肿瘤微环境（例如低氧环境）刺激能够改变乳腺癌细胞氧化还原稳态和代谢方式、第二信使钙离子信号通路活性、磷酸化网络和信号转导偏好性、染色质表观遗传修饰、端粒酶活性和关键转录因子核转位，促使细胞多潜能因子(pluripotency factor) 表达增加，诱导乳腺癌细胞通过重编程 (reprogramming)过程转变为乳腺癌干细胞，从而增加乳腺癌细胞群体中干细胞比例。上述研究为解析肿瘤细胞重编程过程提供了分子层面的依据，并为成功培养和长期扩增患者来源的原代乳腺癌细胞提供了新思路，即通过改变细胞的生长环境，诱导部分原代乳腺癌细胞发生重编程转变为乳腺癌干细胞，增加乳腺癌干细胞比例，从而实现患者来源的原代乳腺癌细胞体外长期扩增。

10、另外，随着空间科学技术的发展，微重力 (microgravity) 环境对人体生理功能的影响正成为生物医学领域研究热点。空间生物学研究表明，重力变化会导致肿瘤细胞多种生物学特性发生变化，其中包括肿瘤细胞干性的变化。发明人在前期研究中发现，贴壁乳腺癌细胞在微重力环境下培养一段时间后，能够悬浮在培养基中生长并自组装成3d球体结构，而这种3d球体与肿瘤干细胞具有相似的生物学特性。

11、然而，目前现有技术中的各肿瘤模型仍旧存在诸多问题，尤其是缺乏能够准确反映人体内肿瘤真实情况的体外细胞模型成为癌症精准治疗发展过程中的一大阻碍。因此，明确肿瘤细胞重编程过程的分子机制，开发新一代能够准确反映体内肿瘤真实情况的体外肿瘤模型，以满足个体癌症患者的精准治疗需求，具有必要性和紧迫性。

技术实现思路

1、鉴于目前现有技术中，缺乏能够准确反映人体内肿瘤真实情况的体外细胞模型，而这一缺陷已经成为癌症精准治疗发展过程中的一大阻碍。为此，针对现有技术中已有的肿瘤模型所存在的诸多问题，本技术中发明人开发了一种新型原代癌细胞培养技术，使用多向g力发生器模拟10-3g微重力环境，诱导患者来源癌/癌旁组织细胞重编程，维持原代细胞群体干性，实现患者来源的癌/癌旁组织细胞快速、长期、高保真培养。使用本项目研发的模拟微重力诱导重编程 (simulated microgravity-induced reprogramming，smgir) 培养方法，从手术中获取约1mm3体积大小的组织块消化培养，到获得106个细胞以支持体外药物筛选实验仅需7天。

2、根据本技术的一个方面，提供了一种微重力环境培养癌细胞用培养基，所述培养基包括：310~350ml dmem、100~120ml ham’s f12营养混合物、40~60ml 胎牛血清fbs、4~6ml200mm谷氨酰胺溶液、4~6ml 青链霉素混合液、400~600μl氢化可的松/表皮生长因子溶液、240~260μl 10mg/ml胰岛素、4~6μl 25mg/ml两性霉素b、90~110μl 50mg/ml庆大霉素、0.5~1.5μl 5mg/ml霍乱霉素、480~520μl 10mm y-27632。

3、需要说明的是，本技术方案中上述培养基中成分的用量并非唯一，例如本领域技术人员可以根据用量情况，按比例调整该培养基中各组分的用量，上述表述方式仅为表明该培养基中所用到的组分以及各组分所占比例的一种方式，对于本领域技术人员而言应该可以理解，除上述情况外的其他与上述培养基本质相同的培养基组成，都理应落入本技术的保护范围。

4、根据本技术的另一个方面，提供了上述的培养基在微重力环境中培养癌细胞或组织中的应用。

5、可选的，所述癌细胞或组织来源自乳腺癌或卵巢癌。

6、根据本技术的另一个方面，提供了一种癌细胞清洗液，所述清洗液包括a液、b液、c液和d液；

7、所述a液包括：400~600ml pbs缓冲液、4~6ml青链霉素混合液和4~6μl 25mg/ml两性霉素b；

8、所述b液包括：400~600ml上述的培养基和8~12ml青链霉素混合液；

9、所述c液为青链霉素混合液；

10、所述d液为0.04~0.06wt%胰酶原液。

11、需要说明的是，本技术方案中上述清洗液中成分的用量并非唯一，例如本领域技术人员可以根据用量情况，按比例调整该清洗液中各组分的用量，上述表述方式仅为表明该清洗液中所用到的组分以及各组分所占比例的一种方式，对于本领域技术人员而言应该可以理解，除上述情况外的其他与上述清洗液本质相同的清洗液组成，都理应落入本技术的保护范围。

12、根据本技术的另一个方面，提供了上述的清洗液在癌细胞或组织除菌中的应用。

13、可选的，所述癌细胞或组织来源自乳腺癌或卵巢癌。

14、根据本技术的另一个方面，提供了一种上述清洗液的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括如下步骤：

15、s1、将肿瘤组织消化后离心，弃净组织消化液，使用a液充分吹打清洗细胞；离心后弃净a液；使用b液重悬细胞后进行培养；

16、s2、次日观察，若培养基浑浊，但无明显菌丝存在：则吸弃瓶中b液；使用a液充分吹打清洗细胞；吸弃a液；重复2~4次上述操作后，继续使用b液进行培养；若培养基浑浊且有明显菌丝存在：则吸弃瓶中b液；使用a液充分吹打清洗细胞；吸弃a液；使用c液充分吹打清洗细胞；吸弃c液；使用d液充分吹打清洗细胞1~3min；吸弃d液；使用a液充分吹打清洗细胞；吸弃a液；重复2~4次上述操作后，继续使用b液进行培养；

17、s3、每日观察并重复上述s2操作，直至三天后细胞恢复正常无菌状态，即培养基清澈，在镜下观察视野中无细菌及菌丝存在，然后使用培养基进行常规培养。

18、本技术方案基于对来自患者手术取下的癌组织/癌旁组织进行微重力培养从而获得癌细胞模型，而手术中取得的癌组织/癌旁组织情况各异，例如对于卵巢癌中取得的癌组织，手术需要进行开腹操作，并且由于卵巢癌的生长位置导致，其取下的组织非常容易染菌，因此必须进行充分的除菌操作，否则极易导致微重力培养失败从而导致癌细胞模型建立失败，这对于来自患者手术取下的珍贵癌组织/癌旁组织是非常浪费的，对于乳腺癌组织其生长环境虽然更稳定不易染菌，然而手术过程中以及组织保存或者转移过程仍旧具有染菌的风险，因此如果不解决染菌导致培养失败的问题，是无法真正应用来自患者手术取下的癌组织/癌旁组织，进行微重力环境下原代癌细胞模型建立的。

19、根据本技术的另一个方面，提供了一种癌细胞消化液，所述消化液包括：800~1000μl collagenase/hyaluronidase dmem溶液、7800~8400μl 上述的培养基和2~5ml 分散酶的hbss溶液，其中分散酶在hbss中的浓度为4~6u/ml。

20、需要说明的是，本技术方案中上述消化液中成分的用量并非唯一，例如本领域技术人员可以根据用量情况，按比例调整该消化液中各组分的用量，上述表述方式仅为表明该消化液中所用到的组分以及各组分所占比例的一种方式，对于本领域技术人员而言应该可以理解，除上述情况外的其他与上述消化液本质相同的消化液组成，都理应落入本技术的保护范围。

21、根据本技术的另一个方面，提供了上述的癌细胞消化液在消化癌细胞或组织中的应用。

22、可选的，所述癌细胞或组织来源自乳腺癌或卵巢癌。

23、根据本技术的另一个方面，提供了上述的消化液的使用方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

24、1）使用无水乙醇对眼科镊和刀片进行消毒；

25、2）将配制好的所述消化液移入离心管中；

26、3）使用眼科镊夹取组织，并置于无菌培养皿中，随后使用刀片切碎组织至小米粒大小；

27、4）将切碎后的组织肉糜移入放有所述消化液的离心管内，拧紧管盖后缠封口膜，置于36~38℃摇床上以200~250rpm的转速消化3.5~4.5h以充分消化组织。

28、根据本技术的最后一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述培养基、和/或如上述清洗液、和/或上述癌细胞消化液。

29、本技术方案建立了一种全新、高效、低成本、高度符合患者病理生理状态的个体化肿瘤模型，能够有效促进癌症尤其是乳腺癌和卵巢癌的精准治疗进程。此外，使用smgir技术培养的原代细胞经多次传代及液氮冻存复苏后仍具备良好的增殖能力，并与患者原组织基因型保持高度一致性，这些特性为后期建立中国乳腺癌患者生物样本“活”库奠定了基础，本技术方案将依托我国临床资源优势，通过技术创新实现肿瘤细胞模型这一源头资源的升级换代，能够大幅促进我国癌症研究和抗癌药物研发的变革和转型升级。

30、本研究通过开发“模拟微重力诱导原代乳腺癌细胞重编程”培养方法，以促进肿瘤个体化治疗进程。本研究旨在通过技术创新实现肿瘤细胞模型升级换代，从源头上推动针对中国肿瘤患者基因特点的癌症研究和药物开发。