RANKL的抗体、抗原结合片段及其用途的制作方法

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及一种特异性结合核因子κ b受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κ b ligand，rankl）的单克隆抗体、抗原结合片段以及包含所述单克隆抗体、抗原结合片段的药物、药物组合及其用途。

背景技术：

1、核因子κb受体活化因子配体（rankl），又称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11（tnfsf11），在骨骼重塑，免疫调节以及乳腺发育等过程中发挥着重要作用。rankl是ⅱ型膜蛋白，主要表达在活化的t细胞、骨髓基质细胞以及成骨细胞上。游离形式的rankl可通过蛋白酶酶解膜受体或mrna替代剪切产生。与其它的tnfsf成员一样，无论是表达在细胞膜上或是游离在细胞外，rankl均形成功能性三聚体。在骨骼重塑方面，rankl是调控破骨细胞分化、融合、活化的关键性细胞因子，通过与表达于破骨细胞表面的rank结合，使得受体三聚化，活化下游信号传导。在破骨细胞分化的各个阶段发挥重要作用，最终促进破骨细胞生成。rankl的另一个天然配体是骨保护素（osteoprotegerin, opg），该蛋白主要由骨髓基质细胞以及成骨细胞分泌，作为诱饵受体阻断rankl/rank的结合。阻断rankl与rank的结合可有效抑制破骨细胞的生成，治疗骨质疏松。地舒单抗(denosumab, 商品名 prolia 或xgeva)作为一款人源的特异性结合rankl的单克隆抗体药物已于2010年获美国fda批上市用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症。该药物可显著降低患者的骨折风险，但治疗过程中可能出现低钙血症、免疫系统抑制等不良反应。在肿瘤治疗方面，靶向rankl的抗体还可被用于治疗rank阳性肿瘤以及阻止肿瘤转移引起的溶骨型病变。已有临床研究显示地舒单抗在前列腺癌患者以及肺癌患者的治疗中可显著提高总生存率。因此开发新型的具有更好效用和安全性的抗rankl抗体药物具有重要意义和价值。

技术实现思路

1、本发明第一方面提供一种靶向rankl的抗体或其抗原结合片段，或与所述抗体或其抗原结合片段具有至少85%序列相同性并保留其rankl结合活性的变体。

2、在一个或多个实施方案中，所述抗体阻断rankl与rank的结合。

3、在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区vh包含（1）seq id no:1或seqid no:9所示的序列，或（2）与（1）具有至少85％序列相同性的序列。

4、在一个或多个实施方案中，所述抗体的轻链可变区vl包含（1）seq id no:5或seqid no:10所示的序列，或（2）与（1）具有至少85％序列相同性的序列。

5、在一个或多个实施方案中，所述抗体包含：seq id no:1所示的重链可变区的3个hcdr，和/或seq id no:5所示的轻链可变区的3个lcdr。

6、在一个或多个实施方案中，所述抗体的hcdr1包含seq id no:2或与其具有至少85％序列相同性的序列。

7、在一个或多个实施方案中，所述抗体的hcdr2包含seq id no:3或与其具有至少85％序列相同性的序列。

8、在一个或多个实施方案中，所述抗体的hcdr3包含seq id no:4或与其具有至少85％序列相同性的序列。

9、在一个或多个实施方案中，所述抗体的lcdr1包含seq id no:6或与其具有至少85％序列相同性的序列。

10、在一个或多个实施方案中，所述抗体的lcdr2包含seq id no:7或与其具有至少85％序列相同性的序列。

11、在一个或多个实施方案中，所述抗体的lcdr3包含seq id no:8或与其具有至少85％序列相同性的序列。

12、在一个或多个实施方案中，所述抗体包含：seq id no:2所示的hcdr1、seq id no:3所示的hcdr2、seq id no:4所示的hcdr3，和/或所述抗体包含：seq id no:6所示的lcdr1、seq id no:7所示的lcdr2、seq id no:8所示的lcdr3。

13、在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区包含鼠源或人源重链fr区。

14、在一个或多个实施方案中，所述抗体的轻链可变区包含鼠源或人源轻链fr区。

15、在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链可变区的fr1、fr2、fr3和fr4各自分别独立选自seq id no:1或seq id no:9中任一所示的重链可变区的fr1、fr2、fr3和fr4，和/或，所述抗体的轻链可变区的fr1、fr2、fr3和fr4各自分别独立选自seq id no:5或seq idno:10中任一所示的轻链可变区的fr1、fr2、fr3和fr4。

16、在一个或多个实施方案中，所述抗体包含：

17、seq id no:1所示的vh和seq id no:5所示的vl，

18、seq id no:1所示的vh和seq id no:10所示的vl，

19、seq id no:9所示的vh和seq id no:5所示的vl，或

20、seq id no:9所示的vh和seq id no:10所示的vl。

21、在一个或多个实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。

22、在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链包含人源igg1、igg2、igg3或igg4的重链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。或，所述抗体的轻链包含人源κ链、λ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。

23、在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链包含人源igg1的重链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列，轻链包含人源κ链的轻链恒定区或与其具有至少85%序列相同性的序列。

24、在一个或多个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

25、在一个或多个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体或完全人抗体。

26、本发明还提供一种融合蛋白或抗体偶联物，其包含本文所述抗体或其抗原结合片段。优选地，所述抗体偶联物是抗体药物偶联物（adc）。

27、本发明还提供多核苷酸，选自：

28、（1）本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的编码序列；

29、（2）（1）的互补序列。

30、本发明还提供一种核酸构建物，其包含本文任一实施方案所述的多核苷酸。

31、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如整合载体、克隆载体或表达载体。

32、本发明还提供含本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段的噬菌体或包含该噬菌体的文库。

33、在一个或多个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段展示于所述噬菌体表面。

34、本发明还提供一种宿主细胞，其：

35、（1）表达和/或分泌本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物；

36、（2）包含本文所述的多核苷酸；和/或

37、（3）包含本文所述的核酸构建物。

38、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞。

39、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

40、本发明还提供一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在适合产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述抗体或其抗原结合片段。

41、本发明还提供一种药物组合物，包含本文所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

42、在一个或多个实施方案中，所述辅料是运载体、稀释剂或赋形剂。

43、在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于预防和/或治疗rankl相关疾病。所述疾病收益于抑制破骨细胞生成。

44、在一个或多个实施方案中，所述rankl相关疾病包括骨质疏松症。

45、在一个或多个实施方案中，所述骨质疏松症包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。

46、本发明还提供本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。所述疾病收益于抑制破骨细胞生成。

47、在一个或多个实施方案中，所述疾病是骨质疏松症。

48、本发明还提供一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物。所述疾病收益于抑制破骨细胞生成。

49、在一个或多个实施方案中，所述疾病是骨质疏松症。

50、本发明还提供一种检测rankl的试剂盒，用于评估药物治疗效果，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、抗体偶联物、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞。

51、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测rankl与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。

52、在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述抗体或其抗原结合片段或分离地存在于试剂盒中。

53、本发明还提供一种检测样品中rankl存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物与样品孵育，和检测rankl与抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物的结合，从而确定样品中rankl存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。

54、本发明还提供本文任一实施方案所述抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、或抗体偶联物在制备用于检测样品中rankl、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。