一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属DNA的特异性PCR引物及其在鉴定白木细蜂属中的应用

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物及其在鉴定白木细蜂属中的应用。

背景技术：

1、基于分类学的准确物种鉴定是人类认知自然和可持续发展的必要前提。它为生物多样性的保护、物种资源的可持续性利用，以及生物来源的新产品开发等方面提供了理论基础。对于物种的鉴定，传统的方法主要是采用形态学证据来进行。但该方法的一些缺陷也造成了濒危动物保护工作的局限，例如表型可塑性和遗传可变性、无法区分隐存分类单元、受生物性别和发育阶段限制等。在寄生蜂分类的科研工作中，一些寄生蜂的体型非常小且具有雌雄差异，已经很难从形态上加以准确识别，而寄生蜂的分类是寄生蜂生物学以及生物防治理论的基础。

2、大痣细蜂科megaspilinae隶属于昆虫纲insecta膜翅目hymenoptera细腰亚目apocrita分盾细蜂总科ceraphronoidea。该物种为体小型，体长约为1-3mm，体色通常为黑色；前翅仅1根翅脉并具1个膨大的翅痣，后翅无翅脉；雌、雄性触角均为11节；中胸盾片通常有中纵沟和盾纵沟的出现；前胸背板侧角向后延伸达翅基片；胫距式为2-2-2。大痣细蜂科寄主范围广范，多为初寄生蜂，少数为重寄生蜂，其中大痣细蜂科白木细蜂属为重寄生蜂，寄主主要为蚜茧蜂科aphiidae、蚜小蜂科aphelinidae等，通常寄生于体表。

3、该物种具有重要的农业经济价值，但研究记录仅述及大痣细蜂科等大类群名称，很多种类并未指出所隶属的确切属、种，更无有关的生物学和生态学知识。除南美洲外，在全世界广泛分布，目前已知12属450余种。但在中国该科物种仅记录2属8种，仍有大量种类有待于发现及鉴定。其中白木细蜂属dendrocerus线粒体基因组变异度高，在进行dna分类鉴定pcr扩增时，使用通用引物难以对提取的大痣细蜂科白木细蜂属dna具有很好的扩增效果。

4、因此，提供一种高效扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物，以此解决使用通用引物对提取的大痣细蜂科白木细蜂属dna扩增效果差的问题是本发明亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服在pcr扩增过程中，使用通用引物对提取的大痣细蜂科白木细蜂属dna扩增效果差的问题，为此提供一种高效的扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物，以及它在鉴定白木细蜂属中的应用。

2、为了解决现有技术存在的问题，本发明采用了以下技术方案：

3、一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物，其包括引物对megaf和megar，所述上游引物megaf序列为:5’-atagaactaatcacaaatttattgg-3’，下游引物megar序列为:5’-taaacttcagggtgaccaaagaatca-3’。

4、上述的一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物，该特异性pcr引物在鉴定大痣细蜂科白木细蜂属中的应用。

5、一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物鉴定方法，其包括以下步骤：

6、(1)设计引物对megaf和megar，所述上游引物megaf序列为:5’-atagaactaatcacaaatttattgg-3’，下游引物megar序列为:5’-taaacttcagggtgaccaaagaatca-3’；

7、(2)随机挑选酒精浸泡的大痣细蜂科白木细蜂属标本，提取待测样品的总dna；

8、(3)采用特异性pcr引物对步骤(2)中提取的总dna进行pcr扩增；

9、(4)取步骤(3)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测。

10、上述的一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物鉴定方法，其所述步骤(2)提取待测样品总dna包括以下步骤：

11、(1)将若干大痣细蜂科白木细蜂属的完整标本置于离心管中，加入200μl缓冲液ga振荡，加入蛋白酶k混匀后，50-60℃放置2.5-3.5h，离心去除管盖内壁的水珠；

12、(2)加入200μl缓冲液gb充分颠倒混匀，60-80℃放置10-20min，待溶液变清亮后离心以去除管盖内壁的水珠；

13、(3)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15-20s，离心以去除管盖内壁的水珠；

14、(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，12000-13000rpm离心30-40s，倒掉废液将吸附柱cb3放回收集管中；

15、(5)向上述的吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000-13000rpm离心30-40s，倒掉废液将吸附柱cb3放入收集管中；

16、(6)向上述的吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000-13000rpm离心30-40s，倒掉废液将吸附柱cb3放入收集管中；

17、(7)重复操作步骤(5)和步骤(6)一次；

18、(8)将上述的吸附柱cb3放回收集管中，12000-13000rpm离心2-3min，倒掉废液，将吸附柱cb3置于室温放置数分钟晾干吸附材料中残余的漂洗液；

19、(9)将上述的吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部分悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000-13000rpm离心1-3min，将溶液收集到离心管中，得到总dna。

20、上述的一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物鉴定方法，其所述步骤(3)的pcr扩增包括以下步骤：

21、(1)向pcr仪的样品管中加入10-15μl mix，每条特异性引物各1-1.5μl，总dna 1-2μl，并用双蒸水补齐至25μl；

22、(2)pcr预变反应：90-100℃预变性5-10min；

23、(3)循环变性反应：所述循环变性反应包括：90-100℃变性30-50s，50-60℃退火40-50s，然后70-80℃延伸1-2min，重复30次；

24、(4)70-80℃延伸5-7min，即可。

25、上述的一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物鉴定方法，其所述步骤(1)中mix为4dntp，taq酶，buffermg2+。

26、上述的一种扩增大痣细蜂科白木细蜂属dna的特异性pcr引物鉴定方法，其所述步骤(3)pcr扩增过程的退火温度为51℃，退火时间为40s。

27、有益效果：

28、本发明通过设计特异性pcr引物，在对大痣细蜂科megaspilidae白木细蜂属dendrocerus dna进行扩增后做的凝胶电泳检测条带显示清晰、明亮且九条泳道中都有条带存在，通过对比验证了本发明设计的pcr引物相较于通用引物在对白木细蜂属dna进行扩增时效果更好，这大大降低了在鉴定白木细蜂属时因使用通用引物而造成鉴定效果差的情况，并节约了一定的科研时间和经济成本。