用于检测沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因或毒力基因的RPA引物及其应用

本发明属于生物，涉及用于检测沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因或毒力基因的rpa引物及其应用，具体涉及一种可同时检测出沙门氏菌及多粘菌素类耐药基因(mcr-1)、毒力基因(sipa)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，rpa)快速检测的引物及其应用。

背景技术：

1、沙门氏菌(salmonella)是肠杆菌科中常见的人兽共患病原菌，不仅能导致鸡白痢、仔猪副伤寒、流产等动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位。

2、在畜禽养殖中，多粘菌素(polymyxin)的使用主要针对一些对常规抗生素耐药的细菌感染，如绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌等。这些细菌对其他抗生素产生耐药性，因此需要使用多粘菌素等特殊抗生素进行治疗。多粘菌素的使用可能导致细菌对多粘菌素和其他抗生素的耐药性增加，这可能导致治疗难度增加，甚至无法有效治疗某些细菌感染。国内外研究表明多粘菌素耐药基因已经在畜禽生产链中出现，多粘菌素耐药基因的出现是由于细菌对多粘菌素类抗生素产生抗性，导致多粘菌素类药物无法发挥其抗菌作用。这种耐药性的产生通常是由于细菌中存在一种或多种耐药基因，这些基因编码了能够阻止多粘菌素类药物进入细菌细胞或破坏细胞膜的蛋白质，从而使得细菌能够抵抗多粘菌素。sipa毒力基因与沙门氏菌的致病性高度相关。沙门氏菌毒力基因sipa能够编码一种分泌蛋白，能够增强沙门氏菌的侵袭力和粘附能力，使其更容易侵入宿主体内并定植。sipa基因的表达是沙门氏菌致病机制的重要因素之一，能够促进沙门氏菌在肠道内的生长和繁殖，从而引起人类和动物的沙门氏菌感染。因此，检测沙门氏菌毒力基因sipa的存在对于预防和控制沙门氏菌感染具有重要意义。高毒力耐药菌株的存在和流行，使得畜禽养殖场的发病率和死亡率都不断上升，引起人们的广泛关注。因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的方法检测携带多粘菌素类药物耐药基因及sipa毒力基因的沙门氏菌。

3、目前沙门氏菌的快速检测方法主要有免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验、免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(elisa)及聚合酶链反应(pcr)技术等方法。但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想。重组酶聚合酶扩增技术(rpa)是近年来开发的核酸扩增技术，相比经典pcr技术，rpa技术具有等温、检测耗时短、灵敏、操作简便等优点，已经逐步应用于沙门氏菌快速检测，但其rpa引物仍有待开发。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种可同时检测沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因(mcr-1)及毒力基因(sipa)的rpa快速检测的引物序列。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

3、一种用于检测沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因(mcr-1)或毒力基因(sipa)的rpa引物，包括三对特异性引物f1/r1、f2/r2、f3/r3，其引物序列如下：

4、f1：cggaacgcgcttgatgagctttaccactgtc

5、r1：agatccatcaaattagcggaggcttccgggt

6、f2：tcgcggacaatctcggctttgtgctgacgat

7、r2：tttagcacatagcgatacgatgataacagcg

8、f3：cagagcgtttgacggcttgcgtgcggaaatat

9、r3：cccgatccacgccaggtttattcaggtatgac

10、本发明的第二个目的是提供上述rpa引物在制备沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因(mcr-1)或毒力基因(sipa)检测产品中的应用。

11、本发明的第三个目的是提供一种检测沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因(mcr-1)或毒力基因(sipa)的产品，所述产品包含上述rpa引物。

12、作为优选，所述产品包括试剂盒和探针。

13、本发明的第四个目的是提供一种检测沙门氏菌、碳青霉烯类耐药基因(mcr-1)或毒力基因(sipa)的方法，包括以下步骤：利用上述rpa引物对待测样本进行rpa扩增，得到rpa扩增产物；用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；其中沙门氏菌扩增后产物大小为458bp，多粘菌素类耐药基因(mcr-1)扩增后产物大小为100bp，毒力基因(sipa)扩增后产物大小为326bp。

14、具体检测方法包括以下步骤：

15、步骤(1).样品dna提取

16、取1ml培养好的菌液加入至1.5ml离心管，12000g离心l min，弃上清，在离心管内加入400μl裂解液，混匀后加600μl酚-氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿-异戊醇混合溶剂，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入与该上清液等体积的氯仿，剧烈振荡，12000g离心10min；取上清液，加入为该上清液0.8倍体积的异丙醇，12000g离心10min；取沉淀，用体积含量为70﹪的乙醇清洗1次，再在常温或50℃下晾干20min，然后加入80μl ph值为8.0的te缓冲溶液溶解，得到dna提取物；该dna提取物即为模板dna；将dna提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板dna的浓度与纯度；

17、所述的酚-氯仿-异戊醇混合溶剂由酚、氯仿、异戊醇按照体积比25：24：1混合而成；

18、所述的氯仿-异戊醇混合溶剂由氯仿、异戊醇按照体积比24：1混合而成；

19、所述的te缓冲液为1ml浓度为1m、ph值为8.0的tris-cl，0.2ml浓度为0.5m、ph值为8.0的edta，定容至100ml溶液；

20、所述的裂解液为tris-hcl、乙二胺四乙酸edta、nacl、蛋白酶k、十二烷基硫酸钠sds组成的混合液，其中tris-hcl的浓度为50mm、ph值为8.0，乙二胺四乙酸edta的浓度为25mm，nacl的浓度为100mm，蛋白酶k的浓度为20μg/μl，十二烷基硫酸钠sds的质量分数为10﹪；

21、步骤(2).rpa扩增

22、将rpa扩增反应体系振荡混匀后，进行rpa扩增，得到扩增产物。

23、所述的rpa扩增反应体系即rpa凝胶检测体系为50μl由含有冻干酶粉的0.2mltwistamp basic反应管中加入再水化缓冲液(rehydration buffer)29.5μl，去离子水8μl，混合引物9μl(10μmol/l)，提取的样品基因组dna 1μl，醋酸镁溶液2.5μl(280mmol/l)组成。

24、将rpa扩增反应体系振荡混匀后，放入37℃恒温金属浴反应20min，得到扩增产物；

25、所述的加入的混合引物为3对特异性引物的混合引物，其中3对特异性引物的浓度比为f1:r1:f2:r2:f3:r3＝1:1:1:1:1:1。

26、步骤(3).扩增产物电泳检测

27、反应结束后，取扩增产物2～3μl，于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如果在458bp处有特异性条带，说明该细菌是沙门氏菌，但不携带多粘菌素类耐药基因(mcr-1)及毒力基因(sipa)；如果在100bp处有特异性条带，说明该菌不是沙门氏菌也不携带毒力基因(sipa)，但是该细菌存在多粘菌素类耐药基因(mcr-1)；如果在326bp有特异性条带，说明该菌不是沙门氏菌也不携带多粘菌素类耐药基因(mcr-1)，但是该细菌存在毒力基因(sipa)；如果在458bp与100bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带多粘菌素类耐药基因(mcr-1)的沙门氏菌。如果在458bp、100bp与326bp处都有特异性条带，说明该细菌为携带多粘菌素类耐药基因(mcr-1)及毒力基因(sipa)的沙门氏菌。无条带则为阴性，说明该菌既不是沙门氏菌又不携带多粘菌素类耐药基因(mcr-1)及毒力基因(sipa)。

28、本发明的有益效果：

29、本发明设计的引物具有较好的种间特异性和种内保守性，能在一次反应中检测出沙门氏菌、多粘菌素类耐药基因(mcr-1)及毒力基因(sipa)，短时间内可判断该菌是否为携带多粘菌素类耐药基因(mcr-1)及毒力基因(sipa)的沙门氏菌，因此更加便捷、高效。本发明方法采用rpa技术进行检测，在保证灵敏、特异的同时，操作简单、耗时短，对携带多粘菌素类耐药基因及毒力基因的沙门氏菌的分子流行病基础提供理论基础和科学依据，在兽医、食品卫生和公共卫生等方面具有重要的意义。