预测放化疗治疗食管癌效果的标志物及其用途的制作方法

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及预测放化疗治疗食管癌效果的标志物及其用途。

背景技术：

1、食管癌（ec）分为食管鳞状细胞癌（escc）和食管腺癌（eac），食管鳞癌在生长速度上一般较慢，且容易出血，远处转移现象出现较晚，因此，该部分患者就诊时已属疾病的中晚期，治疗手段十分有限。应用肿瘤致死量射线并全部消灭恶性肿瘤的原发和转移病灶的根治性放疗（dcrt），被认为是食管癌的治疗中非手术治疗患者的有效选择。

2、在食管癌疾病进展和临床治疗过程中，患者个体差异对食管癌患者放化疗进程的疗效有影响。因此，如何提高放疗的个体化治疗水平，根据患者对放疗的敏感程度制定合理的剂量，使得这部分患者在取得长期生存的前提下，维持更好的生活质量，是临床上关注的热点。

3、国内发明专利cn115261472，数据来源样本缺乏广泛性，样本为血浆样本且标志物单一，虽然血浆中的总mirnas表达水平高于血浆来源的外泌体，血浆中非选择性富集的相关mirna使得检测背景复杂，相关更具诊疗价值的mirna标志物被忽略，单mirna标志物检测体系的特异性与灵敏度无法满足日益增长的临床多样检测需求。因此，寻找与放化疗敏感性相关的一些生物标志物对改善和指导临床肿瘤放射治疗，增进疗效和降低副作用具有重要的理论意义和实用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的技术缺陷，本发明提出了一种无创、灵敏度高、特异性好的用于预测放化疗治疗食管癌效果的标志物及其用途。

2、本发明第一方面提供一种分离的来自哺乳动物的外泌体mirna，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-24-3p和hsa-mir-96-5p。

3、优选地，所述外泌体mirna还包括：hsa-mir-122-5p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-6887-5p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-187-5p、hsa-mir-626及hsa-mir-10394-3p中的一种或多种。

4、优选地，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p和hsa-mir-96-5p。

5、优选地，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p、hsa-mir-96-5p、hsa-mir-100-5p和hsa-mir-6887-5p。

6、优选地，所述外泌体mirna的序列如seq id no:1-seq id no:12所示。

7、本发明第二方面提供检测第一方面所述外泌体mirna的核酸组合物，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-24-3p和hsa-mir-96-5p。

8、优选地，所述外泌体mirna还包括：hsa-mir-122-5p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-6887-5p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-187-5p、hsa-mir-626及hsa-mir-10394-3p中的一种或多种。

9、优选地，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p和hsa-mir-96-5p。

10、优选地，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p、hsa-mir-96-5p、hsa-mir-100-5p和hsa-mir-6887-5p。

11、优选地，所述核酸组合物包括引物和/或探针。

12、优选地，所述引物包括检测每个外泌体mirna的逆转录引物、荧光定量反应的特异性上游引物以及特异性下游引物。

13、进一步优选地，所述外泌体mirna的逆转录引物包含seq id no:13-seq id no:24中任一项所示的序列。

14、进一步优选地，所述外泌体mirna的荧光定量反应特异性上游引物包含seq idno:25-seq id no:36任一项所示的序列，下游通用引物如seq id no:37所示的序列。

15、优选地，所述探针包含seq id no:38-seq id no:49中任一项所示的序列。

16、优选地，所述外泌体来源于血液、唾液、尿液和痰液中的一种或多种。

17、本发明第三方面提供记载有外泌体mirna的序列的介质，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-24-3p和hsa-mir-96-5p。

18、优选地，所述外泌体mirna还包括hsa-mir-122-5p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-6887-5p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-187-5p、hsa-mir-626及hsa-mir-10394-3p中的一种或多种。

19、优选地，所述外泌体mirna至少包括hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p和hsa-mir-96-5p。

20、优选地，所述外泌体mirna至少包括：hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p、hsa-mir-96-5p、hsa-mir-100-5p和hsa-mir-6887-5p。

21、优选地，所述介质是印有所述序列的卡片，或是存储有所述序列和计算机程序的计算机可读介质，当所述计算机程序被处理器执行时，实现以下步骤：将待测样品的外泌体mirna测序数据与所述序列比较时，从而获得所述待测样本中所述序列的mirna表达水平。

22、本发明第四方面提供一种用于预测放化疗治疗食管癌效果的试剂盒，所述试剂盒包括检测第一方面所述的外泌体mirna表达水平的试剂和/或第三方面所述的介质。

23、优选地，所述试剂包括第二方面所述的核酸组合物。

24、优选地，所述试剂盒还包括总rna提取试剂、反转录试剂和荧光定量pcr检测试剂。

25、优选地，所述试剂盒还包括标准品。

26、本发明第五方面提供第二方面任一项所述的核酸组合物或第三方面所述的介质在制备预测放化疗治疗食管癌效果的产品中的用途。

27、优选地，所述放化疗治疗为紫杉类+铂类联合imrt的治疗。

28、优选地，所述紫杉类为紫杉醇和/或多西他赛。

29、优选地，所述铂类为卡铂和/或顺铂。

30、优选地，所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

31、本发明第六方面提供一种用于预测放化疗治疗食管癌效果的系统，所述系统包括：

32、输入模块，所述输入模块用于输入某一对象的外泌体mirna数据，所述数据包括外泌体mirna在样本中的水平或浓度的数据；

33、处理模块，所述处理模块将输入的外泌体mirna数据带入检测模型，从而获得评分；并且将评分与阈值进行比较，从而获得判断结果；

34、输出模块，所述输出模块用于输出所述判断结果；

35、所述外泌体mirna包括hsa-mir-214-5p、hsa-mir-122-5p、hsa-mir-203a-3p、hsa-mir-223-3p、hsa-mir-24-3p、hsa-mir-96-5p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-6887-5p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-187-5p、hsa-mir-626和hsa-mir-10394-3p中的一种或多种。

36、与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

37、发明人围绕用于预测放化疗治疗食管癌效果的标志物及其机制进行了广泛而深入的研究，发现本发明提供的标志物在食管癌患者放化疗治疗的敏感临床样本和不敏感临床样本之前的表达水平存在显著变化，建立了诊断模型。利用该诊断模型判断时，所述生物标志物组合与食管癌患者对放化疗治疗的敏感和不敏感存在显著的相关性，因此本发明提供的生物标志物组合可以预测食管癌患者接受紫杉类+铂类治疗的食管癌效果，具有高灵敏度和高特异性的优点，为预测食管癌患者接受放化疗治疗提供有利的技术支持。

38、本发明提供的标志物为外泌体mirna成为食管癌放化疗疗效预测的有效生物学标志物，为潜在治疗靶点提供了依据，指导临床局部晚期食管鳞癌的个体化治疗。同时，本发明通过血液外泌体标本预测疗效，具有无创性、准确性高等特点，多mirna的联合检测对食管癌放化疗敏感性诊断的特异性为0.846，灵敏度为0.917，准确性为0.903。