一种尿嘧啶核苷酸生产菌株及其定向改造方法与应用

本发明涉及代谢工程及基因工程技术生产领域，尤其是一种尿嘧啶核苷酸生产菌株及其定向改造方法与应用。

背景技术：

1、尿嘧啶核苷酸(uridine5’monophosphate，ump)在农业、畜牧业及医药领域中均有着广泛的应用。现如今，随着人们对尿嘧啶核苷酸功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。

2、当前工业化生产尿嘧啶核苷酸的方式主要是核酸水解法，得力于该方法具有原料足，成本低，生产条件温和等优点，但同时也存在酶解不完全、反应效率较低、分离困难、单核苷酸种类有限及纯度低等问题。随着合成生物学的迅速发展，越来越多研究者已经通过构建微生物细胞工厂发酵生产许多天然产物和化学品来逐渐代替化学法及水解法。现阶段微生物发酵法合成尿嘧啶核苷酸主要为酶催化及全细胞催化法，上述两种方法都需要底物中添加大量的前体物乳清酸，生产成本较高以至于无法实现工业化。因此，现阶段亟需一株可从头高效合成尿嘧啶核苷酸的菌株及工艺。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种尿嘧啶核苷酸生产菌株。

2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的定向改造方法。

3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用。

4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

5、一种尿嘧啶核苷酸生产菌株，为菌株 e.coliump11，是利用定向改造方法在出发菌株 e.coliora12的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在 e.coliora12基因组上敲除了 usha基因、 nagd基因、 sure基因、 yjjg基因、 ygdh基因和 pykf基因,异源引入枯草芽孢杆菌 b.subtilis168中核糖磷酸焦磷酸激酶基因 prs、乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre，过表达磷酸abc转运蛋白基因 pstc、 psta、 pstb，并动态调控尿苷酸激酶基因 pyrh。

6、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，所述出发菌株e.coli ora12为cn202410290893.1（一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用）中菌株e.coli ora12。

7、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，所述定向改造方法是利用crispr/cas9基因编辑技术完全在出发菌株 e.coliora12染色体基因组上进行改造。

8、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，所述usha基因的核苷酸序列如序列表seqid no.1所示；nagd基因的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；sure基因的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；yjjg基因的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示；ygdh基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示；pykf基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示。

9、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，在ylbe位点上整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌b.subtilis 168核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs，并用启动子pbba_j23108调控，并于yeep位点再次整入；经密码子优化后的prs基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示，启动子pbba_j23108的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示。

10、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，在ilvg位点上整合野生型枯草芽孢杆菌 b.subtilis168乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre，并用启动子pbba_j23100调控；乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因和乳清酸核糖基转移酶基因 pyrf- pyre的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；所述启动子pbba_j23100的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示。

11、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，在yjit位点上串联整合磷酸abc转运蛋白基因pstc、psta、pstb，并用同一个启动子pbba_j23108调控；磷酸abc转运蛋白基因pstc-psta-pstb的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示。

12、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，用大肠杆菌鞭毛细丝结构蛋白基因flic的启动子pflic替换尿苷酸激酶基因pyrh的天然启动子；所述尿苷酸激酶基因pyrh的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示，所述启动子pflic的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示，所述尿苷酸激酶基因pyrh的天然启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示。

13、上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的定向改造方法，具体步骤如下：

14、（1）在 e.coliora12基因组上先后敲除usha基因（gene id: 947331）、nagd基因（gene id: 945283）、sure基因（gene id: 947211）、yjjg基因（gene id: 948899）和ygdh基因（gene id: 947266）以阻断ump到尿苷和尿嘧啶的降解途径；敲除pykf基因（gene id:946179）以缩减碳代谢流向tca循环，提高转化率；

15、（2）在ylbe和yeep位点上先后整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌 b.subtilis168核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs（gene id: 936985），并用启动子pbba_j23108调控，异源引入且双拷贝核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs，加强prpp合成；

16、（3）在 ilvg位点上整合野生型枯草芽孢杆菌 b.subtilis168乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf(gene id: 935960)和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre(gene id: 936714)，并用启动子pbba_j23100调控；异源引入且过表达乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre，加强ump合成途径；

17、（4）在yjit位点上串联整合磷酸abc转运蛋白基因pstc(gene id: 948238)、psta(gene id: 948239)、pstb(gene id: 948240)，并用同一个启动子pbba_j23108调控；过表达磷酸abc转运蛋白基因pstc-psta-pstb，加强菌株对磷酸盐利用效率，便于prpp的合成；

18、（5）用大肠杆菌鞭毛细丝结构蛋白基因flic的启动子pflic替换尿苷酸激酶基因pyrh(gene id:944989)的天然启动子，动态调控尿苷酸激酶基因pyrh，便于在保证菌体生长的情况下，加强ump积累。

19、上述尿嘧啶核苷酸生产菌株在发酵生产尿嘧啶核苷酸方面的应用。

20、优选的，上述尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用，使用摇瓶发酵生产尿嘧啶核苷酸，具体步骤如下：

21、（1）种子活化及培养：菌种均匀涂布于活化斜面，37℃培养12 h，转接活化斜面继续培养10 h，再转接至含种子培养基的摇管中进行种子培养；

22、（2）发酵培养：按10-15％接种量接种种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，36℃，200 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持ph在7.0-7.2；添加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行(以苯酚红做指示剂，发酵液颜色不再变化时即视为缺糖，缺糖时补加1-2 ml 60％(m/v)葡萄糖溶液)；发酵周期30-32 h。

23、优选的，上述的尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用，所述种子活化及培养中采用的斜面培养基为：葡萄糖2 g/l，蛋白胨10 g/l，酵母浸出粉5 g/l，氯化钠2.5 g/l，kh2po41.0 g/l，mgso40.2 g/l，琼脂粉25%，其余为水，ph 7.0-7.2；种子培养基为：酵母粉8 g/l，蛋白胨2.0 g/l，(nh4)2so42.0 g/l, kh2po43.0 g/l，vb1 、vb3、vb5、vb12各2 mg/l，vh1 mg/l，mgso4·7h2o 0.5 g/l，钼酸铵0.32 mg/l，硼酸4.5 mg/l，cocl2·6h2o 1.6 mg/l，其余为水；

24、优选的，上述的尿嘧啶核苷酸生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉10 g/l,(napo3)63 g/l，柠檬酸2 g/l，(nh4)2so42.5 g/l，kh2po410.0 g/l，mgso4·7h2o 2.0 g/l，feso4·7h2o 40 mg/l，vb1 1 mg/l，vb3 1 mg/l，vb5 1 mg/l，vb12 1 mg/l，vh0.1 mg/l，钼酸铵0.32 mg/l，硼酸4.5 mg/l，cocl2·6h2o 1.6 mg/l，苯酚红2%（v/v）,其余为水。

25、上述培养基均可采用标准方法制备获得。

26、有益效果：

27、上述尿嘧啶核苷酸生产菌株，利用cripsr/cas9基因编辑技术通过敲除usha、nagd、sure、yjjg和ygdh基因，阻断了ump到尿苷和尿嘧啶降解途径；敲除pykf基因以缩减碳代谢流向tca循环，提高转化率；异源引入并过表达核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs、乳清酸核苷单磷酸脱羧酶基因 pyrf和乳清酸核糖基转移酶基因 pyre；过表达磷酸abc转运蛋白基因pstc-psta-pstb，协同加强ump合成代谢通路；最后，动态调控尿苷酸激酶基因pyrh，在不影响菌体生长的情况下，实现ump快速积累；所获得的菌株不含质粒，无需诱导，具有遗传稳定性好等优势，所述菌株以葡萄糖为底物从头高效合成尿嘧啶核苷酸，经过32 h摇瓶发酵，尿嘧啶核苷酸产量可高达2.3 g/l。