一种敲除14-3-3ε基因的LMH细胞系及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种基于crispr/cas9敲除14-3-3ε基因的lmh细胞系的构建方法。

背景技术：

1、14-3-3ε属于14-3-3蛋白家族。14-3-3蛋白家族包含7个成员(β、ε、η、γ、θ、σ和ζ)，是目前最常见的接头蛋白之一，可调节蛋白磷酸化，参与磷酸化蛋白的信号转导。在真核细胞中，14-3-3蛋白家族作为关键调节因子参与细胞的多种生理过程，如调节细胞周期、细胞内蛋白的转录、细胞凋亡、细胞自噬、细胞迁移、细胞骨架重塑、dna损伤反应以及dna复制等。作为重要的宿主细胞蛋白，14-3-3蛋白家族在一些病毒的感染致病中发挥了非常重要的作用。其中，家族成员14-3-3ε可通过与病毒蛋白互作，进而参与调控某些病毒的感染与复制，如猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(prrsv)、2型腺相关病毒(aav-2)、登革热病毒(dv)以及鸡新城疫病毒(ndv)等。基于宿主蛋白14-3-3ε参与多种病毒的感染与复制，因此，对14-3-3ε的生物学研究将是今后研究病毒感染致病机制的一大重点。现有技术cn113186187a中公开了基于crsipr技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用，其中首次在鸡成纤维细胞系df-1细胞基因组上敲除14-3-3ε基因，使得14-3-3ε蛋白的表达完全丧失，获得14-3-3ε敲除的df-1细胞株，且敲除细胞株活性、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，该技术主要是为了构建df-1敲除的细胞模型，但是其构建的细胞系对于病毒感染复制功能没有深入研究。

2、crispr/cas系统是一种最早发现于古细菌的病毒防御机制系统，对病毒的感染和外来dna的入侵起防御和保护作用。crispr/cas9基因编辑系统主要由rna导向的cas9核酸内切酶、一条导向rna(sgrna)和反式激活rna(tracrrna)组成。在该系统中，crrna(crispr-derivedrna)通过碱基互补配对与tracrrna结合形成双链rna后，引导cas9蛋白识别靶标序列3’端的pam序列(ngg)，并剪切dna，造成dna双链断裂(dsb，double strandbreak)。随后细胞内的dna损伤修复机制启动修复功能，导致碱基随机缺失或插入，从而达到移码突变、沉默基因表达的效果，最终实现目的基因的敲除。由于该技术成本低廉、快速、操作简单且等优点，目前已被大量广泛运用。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用crispr/cas9基因编辑技术构建一个鸡源14-3-3ε基因敲除的lmh细胞系，该细胞系的构建为探究鸡源14-3-3ε的生物学功能与解析14-3-3ε基因在fadv-4以及其他lmh细胞易感病毒的感染复制提供了细胞基础，也为其作用机制研究打下了基础。同时，该敲除细胞系也为高效扩增fadv-4提供细胞基础，解决现有的在fadv-4疫苗生产中无法获得高滴度fadv-4的问题。本发明还提供所述的鸡源14-3-3ε基因敲除的lmh细胞系及应用。

2、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种基于crispr/cas9敲除14-3-3ε基因的lmh细胞系的构建方法，包括以下步骤：

3、(1)设计特异性靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna，所述sgrna位于鸡源14-3-3ε基因的第二个外显子区域，且靶序列唯一；

4、(2)构建含有cas9蛋白基因和上述特异性靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna的敲除质粒；

5、(3)将步骤(2)构建的敲除质粒对lmh细胞进行转染，进行筛选培养后，获得14-3-3ε基因敲除的lmh细胞株，经鉴定后，扩大培养，最终获得14-3-3ε敲除的lmh细胞系。

6、其中，步骤(1)中所述sgrna-5的靶位点位于14-3-3ε基因的第二个外显子，该外显子序列如seq id no.1所示。

7、其中，步骤(1)中所述特异性靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna的编码链及互补链其序列如seq id no.2-3所示。

8、其中，步骤(2)中所述敲除质粒中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和编码sgrna的编码序列。

9、其中，步骤(2)中所述敲除质粒中cas9蛋白基因和sgrna序列位于同一载体上，所述载体为lenticrispr v2。

10、作为优选，步骤(2)构建用于靶向敲除鸡源14-3-3ε基因的crispr/cas9基因编辑系统，crispr/cas9基因编辑系统中含有cas9蛋白和上述特异性靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna编码链和互补链，或者含有携带编码cas9蛋白的编码序列和靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna编码序列；在本发明构建的crispr/cas9基因编辑系统中，cas9蛋白基因和sgrna序列位于同一载体上，所用的载体为lenticrispr v2，构建后的载体命名为lenticrispr v2-14-3-3ε-sgrna。

11、其中，步骤(3)中构建的含有cas9蛋白基因和上述特异性靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna的敲除质粒利用转染试剂对lmh细胞进行转染，通过crispr/cas9基因编辑系统实现对lmh细胞中14-3-3ε基因的沉默，利用含有嘌呤霉素细胞培养液进行筛选培养后，通过细胞亚克隆获得14-3-3ε基因敲除的单克隆lmh细胞株，经鉴定后，扩大培养，最终获得鸡源14-3-3ε敲除的lmh细胞系。

12、作为优选，步骤(3)中将构建的靶向鸡源14-3-3ε基因的敲除载体lenticrisprv2-14-3-3ε-sgrna转染至处于生长对数期的lmh细胞中；利用crispr/cas9基因编辑系统使得目的基因沉默，随后通过药物筛选杀死阴性细胞，再通过亚克隆的方法获得14-3-3ε基因敲除的单个细胞株，扩大培养并鉴定，最终获得14-3-3ε-ko lmh细胞系。

13、其中，步骤(3)中所述的敲除细胞系为敲除鸡源14-3-3ε基因的lmh细胞系(鸡肝癌细胞系)。

14、进一步地，本发明中靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna制备方法为：包括将合成的sgrna编码链和互补链退火形成双链sgrna，利用bsmbi限制性内切酶酶切lenticrispr v2载体，将双链sgrna连接至载体t7启动子下游构建获得敲除载体lenticrispr v2-14-3-3ε-sgrna，制备获得14-3-3ε-ko的细胞系，细胞系为敲除鸡源14-3-3ε基因的lmh细胞系。

15、本发明所述的构建方法所构建的鸡源14-3-3ε敲除的lmh细胞系。

16、本发明所述的构建方法所构建的鸡源14-3-3ε敲除的lmh细胞系在高效扩增fadv-4中的应用。

17、进一步地，本发明所述鸡源14-3-3ε基因在调控lmh细胞的血清4型禽腺病毒(fadv-4)以及其他lmh细胞易感病毒感染复制中的应用。

18、进一步地，所述鸡源14-3-3ε基因的敲除或者沉默在促进血清4型禽腺病毒(fadv-4)在lmh细胞中感染复制中的应用。

19、本发明利用crispr/cas9基因编辑技术构建一个鸡源14-3-3ε基因敲除的lmh细胞系。本发明设计了特定的靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna，并构建至含有cas9基因的lenticrispr v2质粒中获得敲除质粒，将构建的敲除质粒转染至lmh细胞中，利用crispr/cas9系统对靶标序列进行切割，促使靶标基因沉默，再结合药物筛选、细胞亚克隆以及western blot鉴定，最终获得14-3-3ε敲除的lmh细胞系(14-3-3ε-ko lmh细胞系)。

20、本发明通过将靶向鸡源14-3-3ε基因的sgrna插入载体lenticrispr v2，并转染lmh细胞，通过药物筛选，有限稀释及亚克隆，最终获得敲除鸡源14-3-3ε基因的lmh细胞系，并发现该敲除细胞系的生长活性与正常lmh细胞无明显差异，且发现可有效促进fadv-4的感染复制。本发明该敲除的细胞系不仅可应用于fadv-4等病毒的高效扩增，而且可应用于探究鸡源14-3-3ε蛋白的生物功能。因此，本发明具有一定的市场应用价值。

21、本发明通过crispr/cas9基因编辑技术，利用药物筛选和细胞亚克隆的方法，成功获得鸡源14-3-3ε基因敲除的lmh细胞系(14-3-3ε-ko lmh细胞系)，并发现该敲除细胞系的生长活性与正常lmh细胞无明显差异，且发现14-3-3ε-ko lmh细胞系能够有效促进血清4型禽腺病毒(fadv-4)的感染复制。本发明为探究鸡源14-3-3ε生物学功能以及解析14-3-3ε在fadv-4以及其他lmh细胞易感病毒的感染复制中的作用打下了基础，提供了生物材料。

22、本发明通过设计针对靶标蛋白基因的sgrna，且靶标序列唯一。利用crispr/cas 9基因编辑技术对lmh细胞中鸡源14-3-3ε基因进行切割，以达到14-3-3ε基因的移码和沉默，最终实现14-3-3ε基因的敲除。本发明前期设计了5个靶向不同位置的sgrna来进行敲除细胞系的构建，最后发现本发明中的sgrna-5(表1)才能起到了敲除效果。

23、本发明的技术操作简单、快速、高效且成本低廉，并且结合药物筛选和细胞亚克隆技术，获得了14-3-3ε基因完全敲除且稳定的细胞系。目前尚未有鸡源14-3-3ε参与fadv-4感染复制的相关报道，也没有鸡源14-3-3ε应用于fadv-4高效扩增的报道，本发明首次成功获得鸡源14-3-3ε基因敲除的lmh细胞系(14-3-3ε-ko lmh细胞系)，并发现该敲除细胞系的生长活性与正常lmh细胞无明显差异，且发现14-3-3ε-ko lmh细胞系能够有效促进血清4型禽腺病毒(fadv-4)的感染复制。

24、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

25、本发明首次实现了基于crispr/cas9靶向14-3-3ε-ko的lmh细胞系构建，本发明还提出了构建一种基于crispr/cas9基因编辑技术靶向敲除鸡源14-3-3ε基因的方法，基于本发明建立的14-3-3ε-ko lmh细胞系可以有效促进fadv-4的感染复制，并发现该敲除细胞系的生长活性与正常lmh细胞无明显差异。本发明为探究鸡源14-3-3ε的生物学功能与解析14-3-3ε基因在fadv-4以及其他lmh细胞易感病毒的感染复制中的作用机制打下了基础；同时，该敲除细胞系为进一步高效扩增fadv-4以制备高效价fadv-4疫苗提供细胞支持，因此本发明具有较好的应用研究价值。