一种敲减Sema4D基因的iTreg细胞的构建方法及应用与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种敲减sema4d基因的itreg细胞的构建方法及应用。

背景技术：

1、调节性t细胞(regulatoryt cells，treg)是一类异质性cd4+t细胞亚群。根据来源可将treg细胞分为天然产生的自然型treg细胞(naturaltreg cells，ntreg)及外周诱导产生的适应型treg细胞(ptreg细胞/itreg细胞)。据报道，treg细胞主要通过细胞间的串扰机制及分泌抑炎性细胞因子(如il-10、il-35和tgf-β)的方式抑制效应t细胞的成熟、活化及增殖。因此，treg细胞在机体免疫系统稳态平衡中发挥至关重要的作用。其中，叉头盒p3(foxp3)是treg细胞中的关键转录因子，其稳定表达决定treg细胞的效应功能。然而，在极端炎症环境中(如自身免疫性疾病及移植排斥环境)，foxp3+treg细胞比例显著下调导致无序增殖的效应t细胞加速炎症性疾病的发生及发展。近年来发现，分离于自体或异体的cd4+t细胞可在一定的极化条件下进一步分化为具有抑制性功能的诱导型treg细胞(induced-regulatoryt cell，itreg)。更重要的是，多项i/ii期临床试验结果表明treg细胞疗法在预防自身免疫性疾病及抑制实体器官移植排斥反应中均有显著的治疗效果。因此，通过对患者回输itreg细胞改善机体稳态的免疫治疗方法受到广泛关注。

2、尽管treg细胞疗法具有巨大的潜力，但itreg细胞极易失去foxp3的表达并表现出效应t细胞(如th1细胞、th17细胞)的特性。该稳定性缺陷意味着现有技术可扩增得到的itreg细胞无法长期维持功能有效性。因此，探索如何增强itreg细胞的抑制性功能是treg细胞疗法成功应用于临床的关键因素。

技术实现思路

1、为此，本发明提供一种增强itreg细胞功能的构建方法及应用，以解决上述的问题。

2、sema4d(又称cd100)属于信号素蛋白家族，是首个发现于t细胞表面的跨膜信号蛋白。据文献报道，sema4d最初的功能是参与神经系统中神经轴突的引导、血管生成及成骨过程；发明人近期发现，sema4d对t细胞及treg细胞的分化及功能具有重要的免疫调控作用。进一步的，发明人发现，敲减itreg细胞中sema4d基因可有效增强其抑制性功能。此外，将敲减sema4d基因的itreg细胞过继性回输至自身免疫性小鼠可显著缓解受体小鼠的炎症发展。同时，在同种异基因胰岛移植模型中回输敲减sema4d基因的itreg细胞也可有效延长移植物的存活时间。综上，本发明提供了一种以sema4d为靶点增强itreg细胞功能的制备方法，并通过体内及体外实验多方面验证了敲减sema4d基因的itreg细胞在治疗或缓解炎症性疾病的效果。

3、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

4、根据本发明第一方面提供的一种利用敲减sema4d基因增强免疫应答功能的itreg细胞，所述sema4d基因设计的shrna干扰序列：

5、shrna991：ggacgtcctataatttcttgg(如seq id no.2所示)；

6、进一步的，针对shrna干扰序列设计并合成dnaoligos为：shrna991-f：5’-ggacgtcctataatttcttgg-3’(如seq id no.7所示)；shrna991-r：5’-ccaagaaattataggacgtcc-3’(如seq id no.8所示)；

7、进一步的，用于敲减sema4d基因的核苷酸序列如seq id no.13所示。

8、根据本发明第二方面提供的一种敲减sema4d基因的itreg细胞的构建方法，包括：设计sema4d基因的干扰序列，利用干扰序列合成shrna的dna oligos；将合成的用于敲减sema4d基因shrna的dnaoligos进行退火反应，所得的退火产物插入慢病毒载体以获得包含sema4d-shrna序列的dna片段；将上述dna片段转化至感受态细胞并筛选和制备sema4d-shrna的重组质粒；将sema4d-shrna的慢病毒重组质粒与慢病毒包装质粒一同转染至受体细胞，培养48小时后收集含有慢病毒颗粒的上清液。将上清液过滤并与培养基混合后再次感染itreg细胞24小时-48小时，即得到所述敲减sema4d基因的itreg细胞。

9、进一步的，退火反应的条件是，95℃30s，72℃2min，37℃2min，25℃2min。

10、进一步的，通过ageⅰ/ecorⅰ限制性内切酶(restriction enzymes)，以下述酶切体系，主要包括：4μl的载体质粒(500ng/μl)、1μlageⅰ、1μl ecorⅰ、2μl 10x buffer、12μlddh2o完成病毒载体的线性化。随后，将处理好的sema4d shrna目的片段与线性载体进行连接，其反应体系为20μl包括：sema4d的退火产物(1μl)、线性化载体(100-200ng)、10×t4dnaligase buffer(2μl)、t4 dna ligase酶(1μl)、ddh2o(补齐至20μl)，在该反应体系下室温连接30-60min，以获得连接产物；将50-100ng的连接产物加入感受态细胞(dh5α)并挑取单克隆菌落至含有氨苄青霉素(apm)的培养基平板表面，37℃恒温培养，200rpm过夜培养16小时。最后，批量抽提质粒并进行鉴定检测。

11、进一步的，所述受体细胞为hek 293t细胞。

12、进一步的，所述慢病毒包装质粒为慢病毒通用的包装载体，包括delta 8.9以及vsvg包膜蛋白表达载体。

13、进一步的，所述转染受体细胞的方法为钙磷沉淀法。

14、进一步的，所述过滤慢病毒上清液是通过0.45μm滤器过滤；

15、进一步的，所述上清液与培养基混合比为2：1。

16、根据本发明第三方面提供的一种利用敲减sema4d基因增强免疫应答功能的itreg细胞在制备治疗炎症性疾病的产品中的应用。

17、进一步的，所述炎症性疾病包括自身免疫性疾病和/或实体器官移植。

18、本发明敲减sema4d基因的itreg细胞是通过增加foxp3表达，增强其抑制性功能，进而有效缓解自身免疫性疾病的发展，提高同种异基因胰岛移植物的生存率。

19、本发明具有如下优点：

20、本发明通过基因编辑技术及慢病毒感染法构建敲减sema4d基因的工程化itreg细胞，并通过体内及体外实验评估了敲减sema4d的工程化itreg细胞的抑制性功能以及其对炎症性疾病进展的影响。结果发现，sema4d基因敲减的itreg细胞可有效抑制效应t细胞的增殖，该结果表明sema4d基因的敲减可显著增强itreg细胞的功能。同时，将敲减sema4d基因的itreg细胞回输至自身免疫性小鼠及同种异基因胰岛移植小鼠后均可缓解自身免疫性疾病的炎症状态及提高移植物的存活率。本发明公开了一种增强itreg细胞功能的制备方法，该方法通过敲减itreg细胞中sema4d基因，增加foxp3表达及其抑制性效应功能，最终对炎症性疾病(包括自身免疫性疾病和实体器官移植)具有显著的治疗效果。本发明所构建的敲减sema4d基因的itreg细胞可显著增强其免疫应答功能，以解决itreg细胞功能不稳定的问题，为后续treg细胞疗法治疗或改善自身免疫性疾病和实体器官移植提供了理论基础和实验数据。