一种提高二羟基丙酮产量的菌株代谢改造方法与流程

本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种提高二羟基丙酮产量的菌株代谢改造方法。

背景技术：

1、1,3-二羟基丙酮也称二羟基丙酮，简称dha，是最简单的酮糖，外观是白色粉末状结晶，ph为6.0时稳定。因其为还原糖，且无不对称碳原子，故无旋光性，是一种重要的精细化工产品，可作为农药合成中间体、精细化工原料和医药前体，用途广泛。

2、二羟基丙酮的生产主要包括化学合成法和生物转化法。化学合成法存在原料成本高、反应条件苛刻、设备要求高、产品收率低以及污染环境等问题，应用受到一定限制。生物转化法的优势在于反应条件温和、反应专一性强、环境污染小、底物利用率高。

3、目前二羟基丙酮生物合成的主要途径有三种：第一种是以甘油为底物，在甘油脱氢酶的作用下生成二羟基丙酮，具有这种途径的微生物主要有氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter oxydans)、大肠杆菌(escherichia coli)、木醋杆菌(acetobacterxylinum)以及产气克雷伯氏菌(klebsiella aerogenes)等；第二种是以甲醇为底物，在二羟基丙酮合成酶的作用下生成二羟基丙酮，能进行这种生化反应的微生物主要有多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)以及膜璞毕赤酵母(pichia membranifaciens)；第三种是以果糖为底物生成二羟基丙酮，是代谢果糖生成乙醇过程中形成的副产物，主要存在于运动发酵单胞菌中。

4、郑裕国等(cn200510061969.0)利用筛选到的能产二羟基丙酮的微生物菌株，包括葡萄牙棒孢酵母、地衣芽孢杆菌和膜醭毕赤酵母，在摇瓶和发酵罐上进行了二羟基丙酮的直接发酵法生产，甘油转化率达到50-90％，并对发酵液进行分离提取。冯屏等(食品与发酵工业，2005，31:22-26)利用醋酸杆菌游离细胞转化甘油生产二羟基丙酮，甘油起始浓度60g/l，平均转化率为91％。郑裕国(cn20091009 7379.1)利用外循环气升式反应器转化甘油生产二羟基丙酮，采用流加甘油至总浓度300g/l，二羟基丙酮平均转化率为67％。徐虹等(cn201010271671.3)利用gluconobacter oxydans ng-10游离细胞转化甘油生产二羟基丙酮的产率达90％，二羟基丙酮最高浓度可达166.2g/l。刘宇鹏等(cn201110388519.8)利用弗托氏葡萄糖酸杆菌(gluconobacter frateurii)，采用甘油直接发酵法生产，二羟基丙酮最高产量达到170g/l，产率为88.5％。刘宇鹏等(cn201811353424.0)利用日本葡萄糖酸杆菌hd1025的游离细胞转化甘油生产二羟基丙酮的产率达到90％，二羟基丙酮最高发酵浓度达到180g/l。

5、以上菌株实现了以甘油为底物产生高浓度的1,3-二羟基丙酮的生产目的，但是二羟基丙酮的产量和产率及甘油转化率无法同时达到一个较高的水平，或者菌株无法耐受高浓度的甘油。因此筛选出能够耐受高浓度二羟基丙酮并通过改造获得可直接发酵生产高浓度和高产率二羟基丙酮的菌株和技术具有重要意义。

6、通过敲除产二羟基丙酮菌株的相关基因来提高产率是一个发展趋势，如cn116121159a提供了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮产量和生产强度的方法，敲除了氧化葡萄糖酸杆菌中的醛酮脱氢酶基因；cn113174355a提供了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮产量和生产强度的方法，敲除了氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因。

7、敲除脱氢酶是提高二羟基丙酮常用的手段，但是上述发明都是通过摇瓶发酵来检测二羟基丙酮的产量，对于实际大批量生产没有意义。摇瓶提升产量都是通过敲除产酸相关基因获得，通过影响ph从而稳定酶的活性，但是在大罐中发酵生产过程中会通过调节ph抵消此影响，因此这些基因改造对于大批量生产没有正面影响，甚至有些改造影响生长从而产生副作用。因此对于产二羟基丙酮菌株的基因改造还需要考虑到大规模生产的效率。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高产二羟基丙酮菌株的代谢的方法。本方法改造而得的菌株具有耐受高浓度二羟基丙酮的特性，可直接发酵生产高浓度和高产率的二羟基丙酮，并适用于大规模生产。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种提高二羟基丙酮产量的菌株代谢改造方法，敲除产二羟基丙酮的菌株的乙醇脱氢酶相关基因、醛脱氢酶相关基因以及二羟基丙酮激酶，并过表达其pqq合成酶基因及甘油脱氢酶相关基因。

4、进一步地，所述的乙醇脱氢酶相关基因包括adh3、adh4、adh5、adh7以及adh9。

5、进一步地，所述的醛脱氢酶相关基因包括alda和ldd。

6、进一步地，所述的pqq合成酶的来源包括但不限于葡萄糖酸杆菌、谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。

7、进一步地，所述的甘油脱氢酶相关基因包括gdh1和gdh2。

8、更进一步地，所述的甘油脱氢酶相关基因的来源包括但不限于葡萄糖酸杆菌。

9、进一步地，所述的敲除过程中采用sacb的筛选方法。

10、本发明还提供了采用上述方法构建得到的工程菌。

11、本发明进一步提供了采用上述方法构建得到的菌株在生产二羟基丙酮中的应用。

12、本发明还进一步提供了一种生产二羟基丙酮的方法，以甘油为底物，利用上文所述方法得到的菌株进行发酵培养。

13、本发明有益的技术效果在于：

14、1、乙醇脱氢酶相关基因和甘油脱氢酶均为pqq依赖型脱氢酶，敲除乙醇脱氢酶可以释放更多的pqq，pqq的过量可以提高甘油脱氢酶的酶活，从而提高二羟基丙酮的产量。本发明通过敲除pqq依赖型蛋白，从而产生更多的pqq用来传递甘油脱氢酶催化后产生的电子，进而促进二羟基丙酮的表达。

15、2、醛脱氢酶相关基因和甘油脱氢酶均为膜蛋白，本发明通过敲除醛脱氢酶可以减少细胞膜空间的占用，提供更多的膜空间用于表达甘油脱氢酶；通过敲除膜蛋白而从促进甘油脱氢酶的表达量，进而促进二羟基丙酮的生成。

16、3、二羟基丙酮激酶能将二羟基丙酮转化为磷酸二羟基丙酮，不利于二羟基丙酮的积累，本发明通过敲除二羟基丙酮激酶来抑制二羟基丙酮的消耗。

17、4、本发明通过过表达pqq合成酶来提供更多的pqq传递电子，促进甘油脱氢酶的酶活。pqq合成酶能促进pqq的合成，pqq为电子传递链的一环，甘油脱氢酶催化合成二羟基丙酮过程中产生的电子通过pqq传递给氧生成水，过表达pqq合成酶能促进电子的传递，从而促进二羟基丙酮的合成。

18、5、甘油脱氢酶能将甘油转化为二羟基丙酮。过表达了甘油脱氢酶的菌株，其甘油脱氢酶活性显著高于野生菌株，从而促进二羟基丙酮的生成。本发明使用的质粒是自己研发的新型表达质粒，具有高拷贝，低丢失率等特点，因此过表达后的蛋白表达量远远高于低拷贝质粒。

19、6、通过本发明所述方法改造得到的产二羟基丙酮菌株能够在200g/l以上的二羟基丙酮的浓度下生长，发酵得到的二羟基丙酮浓度可达298.6g/l以上，产率可达97.18％以上，并且本发明通过敲除及过表达可以大幅度提高大罐(50l以上罐子)的产量，可达到311g/l以上。