高产他克莫司的链霉菌工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于合成生物技术和微生物发酵，涉及一种通过合成生物技术构建的高产他克莫司的菌株及其构建方法与应用。

背景技术：

1、链霉菌是一类广泛分布的革兰氏阳性细菌，以其丰富的次级代谢产物而闻名。这些代谢产物包括多种抗生素、抗真菌剂、抗癌剂以及其他生物活性化合物。他克莫司，也被称为fk506，是一种具有强大免疫抑制作用的大环内酯类抗生素。它最初是从土壤微生物链霉菌属中分离出来的，特别是在日本发现的筑波链霉菌中含量较高。他克莫司通过结合细胞内的fk506结合蛋白形成复合物，抑制钙依赖性磷酸酶的活性，从而阻断t细胞激活过程中的关键信号传导途径，达到免疫抑制的效果。

2、他克莫司在临床上主要用于预防和治疗器官移植后的排斥反应，尤其是在肝脏、肾脏、心脏以及胰腺的移植中。除了在移植医学中的应用，他克莫司也被用于治疗某些自身免疫性疾病，如重症肌无力、类风湿性关节炎、红斑狼疮和银屑病等。尽管他克莫司具有显著的临床疗效，但其生产过程存在一些挑战。他克莫司的生产主要依赖于链霉菌的发酵过程。而发酵过程中他克莫司的产量通常较低，这限制了其大规模生产和成本效益。此外，发酵过程中可能产生其他代谢副产物，这会增加后续纯化过程的复杂性和成本。

3、不仅是他克莫司，如何筛选和优化菌株、使产率和原料利用率实现最大化是我国微生物发酵工程面临的普遍问题。目前用于提高链霉菌的抗生素产量的方法主要包括两大类，一类是传统的诱变育种方法，通过物理化学方法对菌株进行诱变，然后在诱变后代中筛选高产菌株；例如中国专利cn113717892a提供的链霉菌诱变菌株streptomycestsukubaensis fim-z-a36经过等离子诱变育种技术诱变后，在1吨发酵罐发酵生产他克莫司达3138mg/l，虽然菌株发酵水平提升明显，但稳定性仍有待考证。通过物理化学方法对菌株进行诱变虽然可以得到高产菌株，但它们的不足之处也很明显，主要包括耗费大量人力、物力和时间，筛选工作比较复杂，存在一定盲目性，在引入有利变异的同时可能也会产生很多有害的变异，而有害的菌种变异往往会影响发酵过程的优化和放大；这些传统的菌种选育方式由于对引起功能变化的生物学基础不了解，因此较难推广应用于其他菌种。另一类是通过遗传学的方法，对菌株进行传统的基因工程改造，提高抗生素的产量。例如中国专利cn114045249a提供的基因工程菌streptomyces tsukubaensis l199，该菌株通过引入外源转运蛋白基因、敲除部分代谢竞争性途径并替换他克莫司基因簇中的特定启动子元件获得，在其发酵培养基中添加l-异亮氨酸，将他克莫司的发酵水平稳定在980mg/l左右。另外，在实际生产过程中对发酵工艺进行改进和优化，也是提高抗生素产量的行之有效的手段之一。如中国专利cn101481662a提供的天然菌株streptomyces sp.yn06-1593通过培养基的优化、改进补料工艺等方式在10吨发酵罐发酵生产他克莫司产量达520mg/l。又如中国专利cn112159826a公开的一种提高他克莫司产量的方法，在发酵培养基中加入化感物质补骨脂素、黄樟素，他克莫司产量190mg/l提高至1980mg/l，但黄樟素属于致癌类物质，被严禁添加到食品药物中。

4、由此可见，现有他克莫司的生产仍具有性能稳定性不足、应用范围窄、产量低等不足。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足，本发明提出了一株高产他克莫司的链霉菌工程菌及其构建方法与应用。本发明通过合成生物技术手段改造出发菌株链霉菌并优化了发酵培养液以提高他克莫司的产量。

2、本发明采用的技术方案具体如下：

3、一、链霉菌

4、所述链霉菌的命名为：筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)qz001，保藏日期：2024年5月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc 30637，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

5、二、链霉菌工程菌

6、所述链霉菌工程菌的出发菌株为链霉菌，所述链霉菌工程菌的基因组中敲除tdha基因和tcdh基因且包含基因表达盒，所述基因表达盒过表达sarp家族调控蛋白；所述tdha基因的序列如seq id no.1所示，所述tcdh基因的序列如seq id no.2所示。

7、所述sarp家族调控蛋白由tulz基因编码，所述tulz基因的序列如seq id no.3所示。

8、所述链霉菌工程菌的出发菌株为如权利要求1所述的链霉菌，所述链霉菌工程菌的命名为：筑波链霉菌(streptomyces tsukubaensis)qz004，保藏日期：2024年5月15日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc 30638，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

9、三、链霉菌工程菌的构建方法

10、所述构建方法包括以下步骤：

11、(a)利用同源重组技术敲除出发菌株中的tdha基因，得到qz002菌株；

12、(b)利用同源重组技术敲除所述qz002菌株中的tcdh基因，获得qz003菌株；

13、(c)利用同源重组技术将他克莫司sarp家族调控蛋白的编码基因tulz基因整合到所述qz003菌株的基因组中，获得所述链霉菌工程菌qz004菌株。

14、其中，所述同源重组技术优选为接合转化法。

15、其中，所述步骤(c)具体为：获取tulz基因作为目的基因，将目的基因插入穿梭质粒中构建得到过表达载体，将过表达载体接合转移至所述qz003菌株中，获得所述链霉菌工程菌。优选地，将目的基因—tulz基因插入穿梭质粒的ndei和xbai酶切位点间，所述穿梭质粒可以为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pij8660。

16、其中，所述步骤(c)具体包括以下步骤：

17、(c1)构建过表达载体：以qz001基因组dna为模板，pce-tulz-f/r为引物，通过pcr扩增出tulz基因，然后将目的基因片段tulz基因插入穿梭质粒中，构建出过表达载体；

18、(c2)将过表达载体转化到感受态细胞中，筛选后获得供体细胞，接着将所述qz003菌株的孢子悬液经热激萌发后作为受体细胞，将供体细胞和受体细胞混合涂布在平板上，经培养、筛选后获得所述链霉菌工程菌qz004菌株。其中，供体细胞与受体细胞的浓度比优选为1：2。

19、四、生产他克莫司的方法

20、所述方法具体为：采用发酵培养基培养所述链霉菌工程菌，培养结束后获得发酵产物，从所述发酵产物中分离出他克莫司。

21、所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖10g/l，麦芽糊精50g/l，酵母粉15g/l，棉籽饼粉30g/l，k2hpo4 2g/l，异亮氨酸6g/l，碳酸钙2g/l。

22、优选的，所述的含有添加成分的发酵培养基的ph为7.0。

23、优选的，所述的链霉菌工程菌的发酵水平高达2067mg/l左右。

24、所述培养条件为：在200～220rpm、28～30℃下发酵培养144～192小时。

25、五、链霉菌以及链霉菌工程菌在生产他克莫司、他克莫司衍生物或者其他抗排异药物中的应用。

26、六、链霉菌工程菌的构建方法或者生产他克莫司的方法在生产他克莫司、他克莫司衍生物或者其他抗排异药物中的应用。

27、本发明的有益效果如下：

28、1、产量提升：本发明提供的链霉菌工程菌qz004的他克莫司发酵水平显著提高，达到了2067mg/l。

29、2、菌株特性：本发明提供的链霉菌工程菌qz004具备稳定的遗传特性、简化的发酵流程以及丰富的发酵产出，适合他克莫司的规模化生产。

30、3、应用范围广：本发明提供的菌株和生产方法适用于高产他克莫司及其衍生物或抗排异药物的生产，具有广泛的应用前景。

31、4、本发明通过改进发酵培养基的配方，进一步了提高菌株的发酵水平。

32、5、本发明采用合成生物学的方法将功能已知的基因进行改造，增强了操作的针对性，而且使工作量大大降低，筛选时间也得到缩短。