免疫细胞CIK的制备方法及其在治疗癌症中的应用与流程

本技术涉及生物领域，具体的涉及免疫细胞cik的制备方法及其在治疗癌症中的应用。

背景技术：

1、癌症一直以来都是世界范围内的一个主要公共卫生问题，对男性而言，前十大患病率最高的肿瘤依次是前列腺癌、肺癌、结直肠癌、膀胱癌、皮肤黑色素瘤、肾癌、非霍金奇淋巴瘤、口腔癌、白血病和胰腺癌，其中前列腺癌占比29％。对女性而言，前十大患病率最高的肿瘤依次是乳腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、皮肤黑色素瘤、非霍金奇淋巴瘤、甲状腺肿瘤、胰腺癌、肾癌、和白血病，其中乳腺癌占比31％。随着医疗水平的快速发展，癌症的生存率也有了明显的提升，癌症的治疗方法也已经有很多种。

2、cik细胞疗法，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller，cik)，是一种过继性细胞疗法，是指外周血/骨髓/脐血来源的单个核细胞在体外经过多种细胞因子(如抗cd3单克隆抗体、il-2和ifn-γ等)刺激诱导培养后获得的一群异质细胞。cik细胞疗法的主要效应细胞为cd3+/cd56+细胞，由于同时表达cd3和cd56两种膜蛋白分子，故又被称为nk细胞样t淋巴细胞，兼具有t淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和nk细胞的非mhc限制性杀瘤优点。因此，应用cik细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

3、目前许多研究报道已经证实，cik细胞具有强大的抗肿瘤活性，但其具体的杀瘤和调节机制尚未完全弄清，其可能的机制包括：cik细胞表达fasl，能通过fas-fasl途径诱导fas+肿瘤细胞的凋亡。同时cik细胞也表达fas，但与以往的效应细胞(如til)不同，cik细胞不仅能抵抗fasl+肿瘤细胞诱导的细胞凋亡，而且能够杀伤fasl+(即fas-细胞)其杀伤活性等同于杀伤fas+肿瘤细胞。黏附分子和共刺激分子在效应细胞杀伤靶细胞过程中也发挥一定的作用，在cik细胞杀伤肿瘤细胞过程中是否也有这些黏附分子的参与有待进一步研究，但其lfa/cd11a和icam-1/cd54在介导cik细胞的细胞毒作用中的重要作用是可以肯定的。通过实验证实了cik细胞通过胞质颗粒的释放和blt酯酶的产生来杀伤靶细胞，主要通过有两条途径，一条为cik细胞表面黏附分子lfa-1与icam-1的相互作用刺激cik细胞脱颗粒并释放blt酯酶,这条途径受第二信使camp的调控(dpcamp抑制cik细胞的杀瘤活性)，但不受免疫抑制药物csa和fk506的影响；另一条为cik细胞通过其表面cd3或cd3样表面受体与cd3-mcab的相互作用刺激cik细胞脱颗粒并释放blt酯酶。与第一条途径不同的是，这条途径既受第二信使camp的调控，又受免疫抑制药物csa和fk506的影响。cik细胞培养上清中含有具有生物学活性的可溶性fasl，cik细胞能分泌trail(trail)，且在cik细胞培养中trail出现上调趋势，trail能诱导jurkat细胞的凋亡，同时cik细胞自身还能分泌il-2、il-6、tnf-α等细胞因子,提高细胞毒作用。

4、研究表明，与单独使用cik细胞治疗方法相比，cik细胞联合治疗方法可以获得更好的抗肿瘤反应和os率。例如在利用cik联合西妥昔单抗治疗胃癌的研究中，结果显示egfr单抗未能显著提高cik细胞和sgc7901的结合率，但egfr单抗与cik细胞联合对胃癌细胞的杀伤率和裸鼠移植瘤抑制率明显高于两者单用。在开展的抗egfr/抗cd3双功能抗体在裸鼠体内介导cik细胞杀伤胃癌细胞能力的研究，结果显示其杀伤活性较好，强于其他细胞免疫治疗。cik细胞疗法联合分子靶向药物可增强对胃癌的杀伤，抑制瘤体生长，为临床综合治疗胃癌提供可行性。作为一种很有前途的治疗方法，基于cik细胞的免疫治疗被广泛应用于恶性肿瘤领域。但是目前，较好疗效的联用治疗方法的开发还有待于进一步的提高。

技术实现思路

1、本发明首先提供了一种免疫细胞cik的制备方法。

2、具体的，所述的cik细胞的制备方法为本领域常规的制备方法。

3、本发明进一步的，还提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述组合物含有本发明的cik细胞以及特异性针对egfr的单克隆抗体。

4、进一步的，本发明的癌症是皮肤癌。

5、具体的，本发明的egfr的单克隆抗体为egfr单克隆抗体3f3，轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。

6、将本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔(例如，吸入)、经皮(即，局部)、跨粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠调节ph。可将肠胃外制剂装入用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶内。适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性)或分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉剂。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、tmcremophor el或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物可为无菌并且应为易于注射程度的流动性。它可在生产和储存条件下稳定并且必须保存免受微生物，例如细菌和真菌的污染作用。载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质及其混合物。例如，可通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过在分散情况下保持所需粒径和通过使用表面活性剂保持适当的流动性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现微生物作用的预防。在许多情况下，在组合物中可优选包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)、氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铅和明胶)包括在组合物内引起可注射组合物的延长吸收。

7、进一步的，该药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。可使用任何适合的药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能选择适合的药物赋形剂。适合的赋形剂的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。特定赋形剂是否适合掺入药物组合物或剂型中取决于本领域中熟知的各种因素，包括但不限于将向受试者施用剂型的方式和剂型中的特定抗体。如果需要，组合物或单一单位剂型还可含有少量润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。因此，以下提供的药物赋形剂旨在是说明性的，而不是非限制性的。

8、在一些实施例中，该药物组合物包含消泡剂。可使用任何适合的消泡剂。在一些方面，该消泡剂选自醇、醚、油、蜡、硅酮、表面活性剂和其组合。在一些方面，该消泡剂选自矿物油、植物油、亚乙基双硬脂酰胺、石蜡、酯蜡、脂肪醇蜡、长链脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、硅醇、氟硅酮、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基硅氧烷-二氧化硅、醚、辛醇、脱水山梨糖醇三油酸酯、乙醇、2-乙基-己醇、二甲聚硅氧烷、油醇、西甲硅油和其组合。

9、在一些实施例中，该药物组合物包含共溶剂。共溶剂的说明性实例包括乙醇、聚(乙)二醇、丁二醇、二甲基乙酰胺、甘油和丙二醇。在一些实施例中，该药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的说明性实例包括乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化物、二乙醇胺、单乙醇胺、甘氨酸、甲硫氨酸、瓜尔胶和谷氨酸一钠。在一些实施例中，该药物组合物包含载剂或填料。载剂或填料的说明性实例包括乳糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨醇、壳聚糖、硬脂酸、黄原胶和瓜尔胶。在一些实施例中，该药物组合物包含表面活性剂。表面活性剂的说明性实例包括d-α生育酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、氯化十六烷吡啶、多库酯钠、山嵛酸甘油酯、单油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、肉豆蔻醇、磷脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧甘油酯、月桂基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯和维生素e聚乙二醇琥珀酸酯。在一些实施例中，该药物组合物包含抗结块剂。抗结块剂的说明性实例包括磷酸三钙、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和氧化镁。可用于药物组合物的其他赋形剂包括例如白蛋白、抗氧化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、生物可吸收聚合物、螯合剂、控制释放剂、稀释剂、分散剂、溶解增强剂、乳化剂、胶凝剂、软膏基质、渗透增强剂、防腐剂、增溶剂、溶剂、稳定剂和糖。

10、任何适合的癌症均可用本文提供的抗体和cik细胞的组合治疗。说明性适合的癌症包括例如急性淋巴细胞性白血病(all)、急性髓系白血病(aml)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、脑肿瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳腺癌、支气管肿瘤、原发性未知癌、心脏肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、导管癌、胚胎瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、嗅神经母细胞瘤、纤维组织细胞瘤、尤文肉瘤、眼癌、生殖细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、唇癌和口腔癌、肝癌、原位小叶癌、肺癌、巨球蛋白血症、恶性纤维性组织细胞瘤、黑色素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、涉及nut基因的中线癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓瘤、胃癌、t-细胞淋巴瘤、畸胎瘤、睪丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌和肾母细胞瘤。

11、本文也提供了含有本发明单克隆抗体的冻干粉末，其可以被再配制为溶液、乳状液和其他混合物而给药。这些制剂也可以被重构和配制为固体或胶。无菌的冻干粉末可以通过将含有单克隆抗体的实体部分溶解在合适的溶剂中或者将含有单克隆抗体的溶液的小等份与合适的溶剂相混合而得以制备。所述溶剂可以含有改善该粉末或由该粉末所制备得到的重构溶液的稳定性的赋形剂或其他药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂。所述溶剂也可以含有缓冲液，诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其他这样的缓冲液，这是本领域技术人员所知道的，通常为约中性ph。随后对溶液进行无菌过滤，再在本领域技术人员已知的标准条件下进行冻干，从而得到冻干的制剂。通常，将由无菌过滤获得的溶液分配入小瓶中进行冻干。每个小瓶可以含有单剂量的化合物，诸如10-1000mg或100-500mg，或者含有多倍剂量的化合物。简言之，冻干粉末可以这样来制备，将右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖或其他合适的试剂以约1-20％的量溶解于合适的缓冲液例如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或其它的本领域技术人员所知道的这样的缓冲液中并使ph约为中性。所获得的混合物进行无菌过滤或处理，以去除微粒并确保其无菌，并分配入小瓶中用于冻干。冻干的粉末可以在合适的条件下例如在约4℃至室温进行保存。

12、进一步的，本发明还可以提供用于检测egfr的单克隆抗体以及检测egfr的试剂盒。当然，可通过适当检测，例如常规类型的免疫检测来检测本发明的抗体。例如，可进行夹心分析法，其中使全长egfr原、egfr或其片段附于固体相。保持培育足够长时间以使样本中的抗体与固体相上的固定多肽结合。首次培育之后，分离固体相和样本。洗涤固体相以去除也可能存在于样本中的未结合材料和干扰物质，例如非特异性蛋白质。随后与第二种标记抗体或与偶联剂(例如生物素或抗生物素蛋白)结合的抗体一起培育含有与固定多肽结合的目标抗体的固体相。这第二种标记抗体可为另一种抗egfr抗体。抗体的标记在本领域中众所周知并且包括放射性核素、酶(例如马来酸脱氢酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、过氧化氢酶)、氟石(异硫氰酸荧光素、若丹明、藻蓝蛋白、荧光胺)、生物素等。与固体一起培育标记抗体并测量与固体相结合的标记。通过本领域的普通技术人员可易于进行这些和其它免疫检测。检测生物样本中egfr的存在或不存在的示例性方法包括从测试受试者获得生物样本和使生物样本与根据本发明所述的标记单克隆抗体接触使得检测出生物样本中egfr的存在。如本文所使用的关于探针或抗体的术语“标记”旨在涵盖通过偶联(即，物理连接)可检测物质和探针或抗体对探针或抗体进行的直接标记以及通过与直接标记的另一试剂反应对探针或抗体进行的间接标记。间接标记的实例包括使用荧光标记的二级抗体检测一级抗体和用生物素对dna探针进行末端标记使得可用荧光标记的链霉抗生物素蛋白检测。术语“生物样本”旨在包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及受试者体内存在的组织、细胞和流体。即，本发明的检测方法可用于检测体外以及体内生物样本中的egfr。例如，体外检测egfr的技术包括酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光法。而且，体内检测egfr的技术包括将标记的抗egfr抗体引入受试者体内。例如，可用放射性标记物标记抗体，可通过标准成像技术检测所述放射性标记物在受试者体内的存在和位置。

13、进一步的，包含cik细胞的药学上可接受的组合物可以包含多种载体和赋形剂。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常没有不良物质。合适的载体和赋形剂及其制剂描述于现有技术中。药学上可接受的载体是指在生物学上或其他方面非不良的材料，即将所述材料施用于受试者而不会引起不良生物作用或与其中所含药物组合物的其他组分以有害的方式相互作用。如果施用于受试者，任选地选择载体以最小化活性成分的降解并最小化在受试者中的不良副作用。如在本文中所使用的，术语药学上可接受的与生理学上可接受的和药学上可接受的同义地使用。药物组合物通常将包含用于在储存中缓冲和保存的试剂并且可以包括用于适当运输的缓冲液和载体，其取决于施用的途径。