一种检测板栗疫病菌的试剂盒、检测方法及应用

本发明涉及一种植物疫病菌的检测体系和检测方法，特别涉及一种果木树疫病菌的检测体系和检测方法，属于生物。

背景技术：

1、板栗疫病菌是一种由栗疫病菌(cryphonectria parasitica)引起的毁灭性病害，是中国植物检疫对象之一。树木感病后，会导致板栗树枝腐烂和溃疡，轻则造成树势衰弱，重则全株乃至使整片栗林死亡，造成严重的经济损失。不同生长期的板栗均可能受到板栗疫病菌的侵染，感病初期无法辨认粗糙树皮上的病斑，从而导致树势衰弱甚至死亡。板栗疫病菌的传统检疫手段主要是通过病斑观察、病原显微特征等，难以对大量植株进行快速检测，费时、费力、人为误差大，难以满足现代对植物病害快速、准确、灵敏的检疫要求，因而易错过最佳防治时期。因此，建立快速、高灵敏度的板栗疫病菌检测技术对板栗疫病的防控具有重要意义。

2、随着分子生物学技术的快速发展，检测和鉴定板栗疫病菌的方法主要有普通pcr和实时荧光pcr。但传统分子生物学检测方法依赖昂贵的仪器设备，步骤复杂、耗时较长，很难满足现场快速检测的需求。基于等温扩增技术(rpa、lamp、raa等)在恒温条件下即可实现核酸扩增，相较于传统pcr技术，大大减少对实验室仪器设备的依赖，并简化检测步骤和时间。但是该方法仍存在一些局限性，如非特异扩增、气溶胶污染、假阳性等，影响快速检测结果的准确性。近年来，因为crispr/cas系统灵敏度高、特异性好，该系统已被开发为一种快速、准确、高灵敏度的分子检测技术。

3、cas12a也被称为cpf1，是一种rna引导的单体核酸内切蛋白酶，属于第二类crispr/cas系统。crispr/cas12a系统的基本原理是crispr rna(crrna)引导cas12a蛋白对靶标序列进行切割后，会对检测体系中带有荧光素或生物素标记的单链ssdna单链进行切割，可通过检测荧光或使用试纸条肉眼直接判读结果，既可实验室检测也可现场检测。基于crispr/cas12a的检测系统因其高灵敏度和特异性而被广泛应用各类病原的检测以及基因编辑。cas12a发挥核酸酶功能的最适温度与raa核酸扩增反应温度相近(37℃)，当其与等温扩增技术结合使用时，检测方法具有双特异性的优势，保证了检测结果的准确性，使检测更加简便快捷。因而可将二者联用，即raa负责恒温扩增靶标序列以提高靶序列的拷贝数，特异性grna引导cas12a蛋白切割靶标基因，同时激活cas12a蛋白反式切割活性，对检测体系中带有荧光素或生物素标记的ssdna探针进行切割，最后通过紫外检测或试纸条判读结果。

4、本发明以板栗疫病菌gti1/pac2家族转录因子sge1序列为靶标，设计特异性的raa引物，并结合特异性grna引物、cas12a切割体系及可视化试纸条开发快速检测体系，该检测方法具有快速、灵敏、特异、操作简便等优势，可适用于现场鉴定，对板栗疫病菌的快速鉴定具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有板栗疫病菌的检测时间长，需要将植物材料拿到检测实验室，通过观察病斑、病原菌形态特征才能确定是否染病，而且检测结果误差大等技术问题，提供一种基于raa-crispr/cas12a技术的快速检测板栗疫病菌的试剂盒、检测方法及应用，本发明的检测试剂盒和检测方法能在野外板栗种植场所，实现现场快速检测、鉴定板栗疫病菌，提供板栗疫病菌的grna引物和raa引物，而且本发明方法在检测板栗疫病菌的过程中，不需要借助复杂的仪器设备，采用肉眼可视化检测技术即可判断板栗是否染病，本发明方法具有快速、灵敏度高、特异性强、操作简便等优势，可适用于现场鉴定，对板栗疫病菌的快速鉴定具有重要意义。

2、为实现上述目的，本发明采取以下技术解决思路：

3、本发明第一方面提供一种快速检测板栗疫病菌的试剂盒，包括：grna引物、raa扩增引物，其中：所述grna引物序列为：seq id no.1或seq id no.2；所述raa扩增引物序列为：seq id no.3，seq id no.4。

4、特别是，所述grna引物序列如下：

5、cp-grna1:uaauuucuacuaaguguagauuuccuugggagcagcagcag，seq id no.1；

6、cp-grna2:uaauuucuacuaaguguagauccgacaugaugcuguuggcc，seq id no.2。

7、序列表中rna的碱基u以t代替。

8、特别是：所述raa扩增引物序列如下：

9、上游引物cp-raa-5f：tcctggacgaccgagccctactccttggaatga，seq id no.3；

10、下游引物cp-raa-5r：ctgctgctgctgctgctgttggtggtgttg，seq id no.4。

11、本发明第二方面提供一种基于raa-crispr/cas12a快速检测板栗疫病菌的试剂盒，还包括用于可视化观察板栗疫病菌的ssdna探针。

12、其中，所述ssdna探针选择为用于可视化荧光检测的板栗疫病菌的ssdna1探针或/和用于cas12/13专用核酸检测试纸条检测的板栗疫病菌的ssdna2探针。

13、其中，所述用于可视化荧光检测的板栗疫病菌的ssdna1探针序列为：ssdna1：5′-fam-ttatt-bhqi-3′，seq id no.11；

14、所述用于cas12/13专用核酸检测试纸条检测的板栗疫病菌的ssdna2探针序列为：ssdna2：5′-fam--tttttttattttttt-biotin-3′，seq id no.10。

15、其中，荧光探针ssdna1的5′端和3′端分别用羧基荧光素(fam)和淬灭基团-1(bhq-1)标记；ssdna2探针的5′端和3′端分别用羧基荧光素(fam)和生物素(biotin)标记。

16、特别是，基于raa-crispr/cas12a快速检测板栗疫病菌的试剂盒还包括：raa核酸扩增试剂盒、crispr/cas12a蛋白、nebuffer2.1缓冲液、无核酸酶水、cas12/13专用核酸检测试纸条。

17、特别是，raa核酸扩增试剂盒包括：缓冲液v、引物cp-raa-5f、引物cp-raa-5r、纯化水、基础反应单元、乙酸镁。

18、其中，cas12a切割体系包括：cas12a蛋白、nebuffer2.1缓冲液、grna引物、探针ssdna、模板和无核酸酶水。

19、本发明第三方面提供一种快速检测板栗疫病菌的方法，包括以下步骤：

20、(1)dna提取：

21、提取板栗疫病菌基因组dna，获得板栗疫病菌基因组gdna，备用；

22、(2)构建t质粒(即基因片段扩增及pmdtm19-t vector连接)

23、首先以提取的板栗疫病菌基因组dna为模板，进行pcr扩增反应；然后将pcr扩增产物与t-载体进行连接反应，构建得到cpsge1-t-vector质粒，简称cp-t质粒；

24、(3)raa扩增处理

25、以步骤(2)构建的cp-t质粒为模板进行raa等温扩增反应，得到raa扩增产物cp-raa；

26、(4)crispr/cas12荧光切割处理

27、将所述raa扩增产物与grna引物、cas12a蛋白、nebuffer2.1缓冲液、探针ssdna和无核酸酶水充分混合，孵育，进行crispr/cas12a荧光切割反应，得到crispr/cas12a荧光切割反应产物；

28、(5)荧光可视化检测

29、测定crispr/cas12a荧光切割反应产物的荧光信号，根据荧光信号的有无判断是否含有板栗疫病菌，当检测到荧光信号时，表明含有板栗疫病菌，反之则不含。

30、特别是，步骤(2)中所述pcr扩增反应的引物为cpsge1-5f和cpsge1-5r，其中所述引物cpsge1-5f、cpsge1-5r的序列为：

31、cpsge1-5f：atggacgagcttgtgtcgca，seq id no.5；

32、cpsge1-5r：aaggacgcgaagaactgatcg，seq id no.6。

33、特别是，步骤(2)中所述pcr扩增的程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，重复30个循环；72℃终延伸5min；

34、特别是，步骤(2)中所述pcr扩增的体系为：2×mix 50μl、ddh2o 47μl、gdna 1μl、cpsge1-5f引物1μl、cpsge1-5r引物1μl共100μl。

35、特别是，以提取的板栗疫病菌基因组gdna为模板，以cpsge1-5f和cpsge1-5r为引物进行pcr扩增反应，获得板栗疫病菌cpsge1片段。

36、特别是，还包括将板栗疫病菌cpsge1片段进行回收，纯化后，再与t载体进行连接反应。

37、特别是，所述t载体选择为pgem-t、puc18-t或pmdtm19-t vector，优选为pmdtm19-tvector。

38、特别是，步骤(2)中按照如下步骤进行所述连接反应：将回收纯化后的cpsge1全长片段与t载体连接，即将solution 1 2.5μl、cpsge1全长片段2μl和pmdtm19-tvector 0.5μl添加到pcr管中，离心10s混匀，放入16℃金属浴连接10-12h。

39、特别是，按照pmdtm19-t vector cloning kit试剂盒说明进行操作。

40、特别是，还包括步骤2a)：向连接反应后混合溶液中加入dh5α大肠杆菌感受态细胞，进行大肠杆菌ta克隆转化；筛选阳性克隆后摇菌提质粒，获得cp-t质粒。

41、特别是，按照如下方法进行大肠杆菌ta克隆转化：将连接产物与dh5α大肠杆菌感受态细胞相混合，进行大肠杆菌ta克隆转化，然后将大肠杆菌ta克隆转化体系溶液涂布在添加50μl/ml氨苄青霉素抗性lb平板上，37℃恒温培养箱培养12h，待长出菌落，对单菌落进行挑菌转接，转接到添加50μl/ml氨苄青霉素抗性lb平板上。

42、特别是，按照如下步骤进行所述的筛选阳性克隆：将大肠杆菌ta克隆转化后的体系溶液均匀涂布在添加50μl/ml氨苄青霉素抗性lb平板上，接着于37℃恒温培养箱中培养12h，待长出菌落后，挑取单菌落转接到添加50μl/ml氨苄青霉素抗性lb平板，并以此为模板，使用特异性引物筛选含有cp-t质粒的阳性克隆菌株，然后挑取阳性克隆菌株到lb液体培养基中，于37℃、转速为220rpm的恒温摇床上，培养12h。

43、特别是，所述的特异性引物是pmdtm19-t vector特异性引物，为m13f和m13r，其中引物m13f和m13r序列如下：

44、m13f：cgccagggttttcccagtcacgac，seq id no.7；

45、m13r：agcggataacaatttcacacagga，seq id no.8。

46、特别是，还包括点取阳性克隆菌株加到lb液体培养基中，在温度为37℃、转速为220rpm的恒温摇床上，培养12h，然后进行摇菌提质粒，获得所述的cp-t质粒。

47、特别是，采用快速质粒小提试剂盒提取大肠杆菌ta克隆产物。

48、特别是，步骤(3)中所述raa扩增反应的引物为cp-raa-5f和cp-raa-5r，其cp-raa-5f和cp-raa-5r序列如下：

49、cp-raa-5f：tcctggacgaccgagccctactccttggaatga，seq id no.3；

50、cp-raa-5r：ctgctgctgctgctgctgttggtggtgttg，seq id no.4。

51、特别是，采用raa核酸扩增试剂盒，以cp-raa-5f和cp-raa-5r引物，以步骤(2)构建的cp-t质粒为模板进行raa等温扩增处理，将raa扩增体系混合后，于37-42℃的条件下进行raa扩增反应40±5min，获得raa扩增产物。

52、raa扩增反应不借助pcr仪，可以在野外进行扩增反应。

53、普通pcr的产物只是用来筛选最佳grna、cas12和grna的量，在明确为grna1，以及添加cas12(0.125ul)和grna(0.25ul)后使用的是raa产物进行荧光检测。进行普通pcr能够增加扩增倍数，和raa扩增相比能够获得更多cpsge1-raa片段，进而更好的验证cas12a蛋白切割活性，以及筛选grna序列。

54、特别是，按照如下步骤进行所述raa扩增反应，首先：按照缓冲液v 25μl、引物cp-raa-5f 2μl、引物cp-raa-5r 2μl、纯化水14.5μl进行raa扩增体系配置，置于基础反应单元中，并手弹混匀并短暂离心；随后加入5μl的乙酸镁，并充分混匀后加入1.5μl步骤(2)构建的cp-t质粒，充分混匀；然后放入37℃预热的金属浴仪器中反应40min，获得raa扩增产物(简称cp-raa)。

55、特别是，基础反应单元、缓冲液v、乙酸镁为raa核酸扩增试剂盒的成分。

56、其中，raa核酸扩增试剂盒组分：基础反应单元(12t/pack)、缓冲液v(1500μl/tube)、纯化水(1500μl/tube)、乙酸镁(600μl/tube)、基础阳性质控品(25μl/tube)、基础阳性对照正向引物(25μl/tube)、基础阴性对照正向引物(25μl/tube)。

57、特别是，还包括步骤3a)，raa扩增反应结束后，向每个管内加入酚氯仿(1:1)混合物50μl，混匀后置于离心机上离心使其分层。

58、取适量分层后的上清液用2％琼脂糖凝胶电泳的方法进行鉴定，验证cp-raa-5f和cp-raa-5r引物是否正确，确保设计的引物能够用于cpsge1检测。

59、特别是，步骤(4)中所述的grna引物选择为grna1或grna2，其中grna1或grna2的序列如下：

60、grna1:uaauuucuacuaaguguagauuuccuugggagcagcagcag，seq id no.1；

61、grna2:uaauuucuacuaaguguagauccgacaugaugcuguuggcc，seq id no.2。

62、特别是，所述的grna引物选择为grna1。

63、步骤(4)中所述的探针-ssdna为用于可视化荧光检测的板栗疫病菌的ssdna1探针或用于cas12/13专用核酸检测试纸条检测的板栗疫病菌的ssdna2探针，其中：ssdna1探针序列为seq id no.11；ssdna2探针序列为seq id no.10。

64、特别是，所述的ssdna1探针序列为：ssdna1：5′-fam-ttatt-bhqi-3′，seq idno.11；所述的ssdna2探针序列：ssdna2：5′-fam--tttttttattttttt-biotin-3′，seq idno.10。

65、特别是，步骤(4)中按照如下步骤进行所述的crispr/cas12a荧光切割反应：将raa扩增产物与grna引物、cas12a蛋白、nebuffer2.1缓冲液、探针ssdna1和无核酸酶水充分混合，孵育，接着于37℃下进行crispr/cas12a荧光切割反应，其中cas12a蛋白切割反应1h过程中每隔5min测定一次荧光值，得到crispr/cas12a荧光切割反应产物。

66、特别是，步骤(4)中按照如下步骤进行所述的crispr/cas12a荧光切割反应：将raa扩增产物与grna引物、cas12a蛋白、nebuffer2.1缓冲液、探针ssdna2和无核酸酶水充分混合，孵育，接着于37℃下进行crispr/cas12a荧光切割反应，其中cas12a蛋白切割反应40min后，将切割反应溶液稀释10倍，随后将cas12/13专用核酸试纸条进入稀释液中孵育2min，然后观察cas12/13专用核酸检测试纸条判读区内有检测线(t)和质控线(c)的显色结果。

67、特别是，按照如下步骤进行所述的crispr/cas12a荧光切割反应：按照nebuffer2.1 5μl、cas12a protein(100μm)0.125μl、grna1引物(50μm)0.25μl、ssdna1(100μm)0.25μl、模板cp-raa2μl、ddh20 42.375μl配制cas12a蛋白切割体系，反应体系共50μl；接着于37℃下在荧光定量pcr仪内进行cas12a蛋白切割反应，其中在cas12a蛋白切割反应过程中每隔5min测定一次荧光值，结束后保存数据并进行分析。

68、特别是，cas12a蛋白切割反应的反应体系加入pcr八连排管中，使用lc96荧光定量pcr仪，选择fam通道。于37℃反应1h，每隔5min测定一次荧光值，结束后保存数据并进行分析。反应完成后置于紫外凝胶成像仪下观察荧光状态并拍照。

69、特别是，按照如下步骤进行所述的crispr/cas12a荧光切割反应：按照nebuffer2.1 5μl、cas12a protein(100μm)0.125μl、grna1引物(50μm)0.25μl、ssdna2(10μm)0.5μl、模板cp-raa2μl、ddh20 42.125μl配制cas12a蛋白切割体系；接着于37℃下在金属浴内进行cas12a蛋白切割反应40min后，精确吸取切割反应产物，并将反应产物稀释10倍，随后利用cas12/13专用核酸试纸条进行孵育处理，用试纸条孵育处理2min后，进行拍照观察，观测cas12/13专用核酸试纸条的判读区内有检测线(t)和质控线(c)的显色结果。

70、特别是，cas12a蛋白切割体系中grna引物(grna1)和cas12a蛋白的最佳浓度配比分别为0.25μm和0.25μm。

71、特别是，cas12/13专用核酸试纸条的判读区内质控线(c线)和检测线(t线)均出现红色条带；质控线(c线)不显色，检测线(t线)出现红色条带，这两种情况则表明含有板栗疫病菌；质控线(c线)出现一条红色条带，检测线(t线)不显色，判定为阴性结果，不含有板栗疫病菌；质控线(c线)和检测线(t线)均未出现条带，提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误。

72、特别是，还包括按照如下步骤筛选引物grna：

73、a)以cp-raa-5f和cp-raa-5r为引物，以步骤(2)构建的cp-t质粒为模板进行pcr扩增，扩增得到cpsge1-raa片段；

74、b)以步骤a)pcr扩增获得的cpsge1-raa片段为模板，分别添加引物grna1或grna2，以加水的模板作为阴性对照，采用raa核酸扩增试剂盒，按照nebuffer2.1 5μl、cas12aprotein(100μm)0.5μl、引物grna(50μm)1μl、ssdna1(100μm)0.25μl、cpsge1-raa2μl、ddh2041.5μl反应体系进行配置，并加入pcr八连排管中，使用lc96荧光定量pcr仪，选择fam通道，于37℃反应1h，每隔5min测定一次荧光值，结束后保存数据并进行分析；

75、c)在紫外光下可观察到引物grna的反应产物荧光强度，选择荧光强度亮、切割反应产物的荧光值呈线性上升，线性化程度高，荧光峰值高的引物。

76、其中，步骤a)中所述的pcr扩增体系包括：2×mix 50μl、ddh2o 47μl、cp-t质粒1μl、cp-raa-5f引物1μl、cp-raa-5r引物1μl共100μl。

77、特别是，步骤a)中所述的pcr扩增程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸10s，重复30个循环；72℃终延伸5min。

78、特别是，所述引物cp-raa-5f和cp-raa-5r的序列如下：

79、cp-raa-5f：tcctggacgaccgagccctactccttggaatga，seq id no.3；

80、cp-raa-5r：ctgctgctgctgctgctgttggtggtgttg，seq id no.4。

81、特别是，步骤b)中cpsge1-raa和grna分别按照cpsge1-raa+grna1、cpsge1-raa+grna2进行配置；阴性对照以水为模板，分别按照模版为水+grna1、模版为水+grna2进行配置。

82、特别是，所述grna引物的序列如下：

83、cp-grna1:uaauuucuacuaaguguagauuuccuugggagcagcagcag，seq id no.1；

84、cp-grna2:uaauuucuacuaaguguagauccgacaugaugcuguuggcc，seq id no.2。

85、特别是，所述引物grna优选为grna1。

86、特别是，还包括按照如下步骤筛选crispr/cas12a荧光切割反应体系中cas12a单板、引物grna1的浓度：对步骤(4)cas12a蛋白切割体系的cas12a蛋白(1μm、0.5μm、0.25μm)和grna1浓度(1μm、0.75μm、0.5μm、0.25μm)进行正交试验，按照如下用量进行反应体系的配制：nebuffer 2.1 5μl、cas12a protein xμl、grnayμl、ssdna1(100μm)0.25μl、板栗疫病菌的基因组gdna2μl、ddh20 42.75-x-yμl，cas12a蛋白切割体系共50μl，将反应体系加入pcr八连排管中，使用lc96荧光定量pcr仪，选择fam通道于37℃反应1h，每隔5min测定一次荧光值，结束后保存数据并进行分析；选择荧光强度值最高的cas12a蛋白、grna1浓度，体系中grna1和cas12a蛋白的最佳浓度配比分别为0.25μm和0.25μm。

87、本发明在一方面提供一种上述试剂盒在快速检测板栗疫病菌中的应用。

88、本发明的有益效果如下：

89、1、本发明通过设计靶向板栗疫病菌sge1基因序列的特异性raa扩增引物及与之对应的grna，特异性grna引导cas12a蛋白切割靶标基因，同时激活cas12a蛋白非特异性切割属性，对检测体系中带有荧光素或生物素标记的ssdna进行切割，以此来指示检测板栗枝条中是否含有板栗疫病菌sge1基因靶标序列。若不含靶标序列，在紫外光下溶液不会发出荧光；若存在靶标序列，则会发出荧光。

90、2、使用本发明的板栗疫病菌检测试剂盒进行板栗疫病菌检测的方法，灵敏度高，以板栗疫病菌gdna为模版进行raa-crispr/cas12a荧光检测和试纸条检测的灵敏度均可达2.1*101copies/μl，以板栗疫病菌的cpsge1-t-vector为模板时，其raa-crispr/cas12a体系的荧光检测灵敏度可达2.32*103copies/μl，而cas12/cas13专用核酸试纸条的检测灵敏度可达2.32*102copies/μl。

91、3、本发明以板栗疫病菌sge1基因为靶标，构建的raa-crispr/cas12a快速检测方法是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，整个检测过程耗时较短，且在37℃的恒温条件即可完成反应，操作简便，有利于实现板栗疫病菌的现场可视化检测。与传统的pcr方法相比，大大缩短了时间，不需要大型仪器以及专业人员即可完成，尤其适用于野外快速检测。为板栗疫病菌的预防控制提供了一种新的技术手段。

92、4、本发明的板栗疫病菌检测试剂盒可以在野外板栗种植场所，现场实时进行检测，而且检测过程中不需要使用复杂的大型仪器和专业的检测人员，即可快速、准确的获得板栗植物是否感染板栗疫病菌，检测速度快、检测方法的灵敏度、特异性强。