新冠病毒N蛋白和编码S1抗原mRNA分子结合的仿生病毒结构疫苗及其制备方法与流程

本发明属于生物医药，具体的说，涉及一种新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的仿生病毒结构疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、在多种抗sars-cov-2病毒疫苗的研发与应用中，mrna疫苗做为一种以人工合成形式制备的，能够在细胞内表达内源性病毒抗原，从而首先激活天然免疫系统而启动机体的抗病毒免疫反应的新形式疫苗，表现出其免疫效果明显优于其它的灭活疫苗、多肽疫苗形式的特点。已有的研究表明，这一疫苗的优势在于通过的纳米脂质递送系统（lipidnanoparticles delivering system），将可以依赖于细胞内翻译表达体系的复制型或非自主复制型mrna分子递送进入细胞质，表达抗原蛋白，并在此过程中，首先通过外源导入的mrna分子的不同形式和表达的抗原蛋白结合细胞内的天然免疫系统的模式识别受体（pattern recognition receptor, prr），激活天然免疫反应系统，从而通过细胞释放的免疫信号分子募集组织内包括树突状细胞、巨噬细胞在内的抗原递呈细胞、吞噬由这些细胞中mrna分子表达的抗原，并由此将处理的抗原递呈给t细胞系统，激活获得性免疫反应。基于这一完整的、由mrna分子表达过程激活天然免疫/获得性免疫的过程产生良好的免疫反应的事实，表明mrna疫苗模拟病毒感染过程而引起免疫反应的潜力所在。但值得注意的是，由于mrna疫苗所使用的脂质递送系统是通过非特异性方式与不同细胞膜融合而实现mrna递送，因此，其和病毒通过其膜表面的蛋白与细胞表面的特异性受体相结合的方式进入细胞相比较，具有较低的进入效率和非特异性进入多种细胞的特点。

2、基于此，通过对sars-cov-2病毒结构分析，充分利用病毒表面spike蛋白做为中和抗原的特征和能够与除ace2受体之外的，位于树突状细胞和巨噬细胞表面的dc-sign受体结合的特征，构建了由脂质载体将mrna分子包裹，同时在表面携带s1蛋白的类病毒结构vls（virus-like-structure vaccine）疫苗，并已获得专利授权（公开号cn116139108a）。但基于对sars-cov-2病毒结构的深入分析，以及该病毒在感染宿主过程中其抗原谱与免疫保护反应的相关分析，一种倾向性的意见认为，在针对covid-19群体免疫反应的分析中，除了s抗原为免疫系统重点识别并产生相应的中和抗体阻断病毒的感染之外，病毒的核衣壳结构蛋白n抗原亦被发现作为一种重要的抗原分子，能够引起免疫系统的特异性t细胞反应。而这一反应常常与宿主形成控制病毒增殖的杀伤性t细胞反应相关。而现有的mrna疫苗所使用的抗原均未考虑使用n抗原组分。

技术实现思路

1、基于背景技术中提出的sars-cov-2感染相关的免疫学分析结论，本发明在已获得类病毒结构vls疫苗专利（cn116139108a）的前提下，进一步设计了构建一种模拟sars-cov-2病毒完整结构的技术，首先在本发明所设计的缓冲液体系中，将原核表达的病毒核衣壳主要结构成分n蛋白与编码s1抗原mrna分子结合，形成类染色质的串珠样结构的生物合成体。在通过chip实验证实n蛋白与mrna分子完整结合后，以lnp脂质载体包裹，形成的脂质颗粒结构，在该脂质颗粒结构表面加载真核表达的s1蛋白，形成仿生病毒结构疫苗。经疫苗特征鉴定和全面的免疫学分析，证实了所获得的仿生病毒结构疫苗不仅可以诱导宿主产生更强的抗s抗原的特异性抗体，同时还能产生抗n抗原的特异性抗体。更重要的是，该疫苗可以诱导机体产生很强的抗s抗原和n抗原的特异性t细胞反应，从而强化提高了疫苗免疫反应在病毒攻击中的保护效果。

2、基于此，本发明的第一目的在于提供一种缓冲液体系，该缓冲液体系可以使新冠病毒n蛋白与编码s1抗原mrna分子相结合，形成串珠样的、类病毒核衣壳结构的生物合成体。本发明的第二目的在于提供一种包裹有新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的生物合成体的脂质颗粒结构及其制备方法；本发明的第三目的在于提供一种新冠病毒n蛋白和一种编码s1抗原mrna分子结合的仿生病毒结构疫苗及其制备方法。

3、所述的缓冲液体系（本发明以下所用“缓冲液体系”在未做特殊说明时，均为本成分的缓冲液）：以水为溶剂，溶解naac、nacl、mgcl2、dtt和fucose后获得，缓冲液体系的ph值为6.0-6.4，各物质的浓度分别为，naac，20mm；nacl，10mm； mgcl2，10mm； dtt，1mm；fucose，0.001% w/v。

4、所述的新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的生物合成体的制备方法，使用上述缓冲液体系，包括以下步骤：

5、（1）将新冠病毒编码s1抗原mrna溶于ph=6.0-6.4的te buffer，配置浓度为1000ug/ml；

6、（2）将原核表达的新冠病毒n蛋白溶于ph=6.8-7.2的te buffer，配置浓度为200ug/ml；

7、（3）（3）将步骤（1）的mrna和步骤（2）的n蛋白以5:1的浓度比加入上述的缓冲液体系，35-39℃反应28-32min，获得新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的生物合成体。

8、包裹有新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的生物合成体的脂质颗粒结构的制备方法，包括如下步骤：

9、（1）将脂质dha-1、dotap、dopc与mpeg-dta-1-2k以56：10：27：1.6的摩尔比混合于无水乙醇中；同时用含naac 20mm，nacl 10mm， mgcl2 10mm,dtt 1mm 和海藻糖为0.001%(w/v)的缓冲液稀释权利要求4的生物合成体；

10、（2）用微流控设备nanoassemblrr ignitetm model制备包裹生物合成体的脂质颗粒结构；

11、（3）将步骤（2）制备的已包裹生物合成体的脂质颗粒结构，去除乙醇，得到氮磷摩尔比为15-18:1的包裹有生物合成体的脂质颗粒结构。

12、所述的新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的仿生病毒结构疫苗，包含新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的生物合成体。

13、所述的新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的仿生病毒结构疫苗，包含氮磷摩尔比为15-18:1的包裹有生物合成体的脂质颗粒结构。

14、所述的新冠病毒n蛋白和编码s1抗原mrna分子结合的仿生病毒结构疫苗的制备方法，通过在权利要求6所述的脂质颗粒结构中加载s1蛋白获得，具体为，

15、将所述的脂质颗粒结构按照编码s1抗原mrna 和s1蛋白以4：1的浓度比加入s1蛋白，室温旋转混匀，然后置于4℃放置16小时, 使用含naac 20 mm，nacl 10 mm，海藻糖0.001%w/v和甘油2.5%的缓冲液稀释后获得。

16、本发明的有益效果：

17、本发明所设计的缓冲液体系，能将原核表达的新冠病毒核衣壳结构的n蛋白与编码s1抗原mrna分子结合形成类染色质的串珠样结构。在通过chip实验证实n蛋白与mrna分子完整结合后，以lnp脂质载体包裹，形成脂质颗粒结构，并在该脂质颗粒结构表面加载真核表达的s1蛋白，获得仿生病毒结构疫苗。经结构特征鉴定和全面的免疫学分析，证实了该仿生病毒结构疫苗不仅可以诱导宿主产生很强的抗s抗原的特异性抗体，同时还能产生抗n抗原的特异性抗体。更重要的是，该仿生病毒结构疫苗可以诱导机体产生很强的抗s抗原和n抗原的特异性t细胞反应，从而强化提高了疫苗免疫反应在病毒攻击实验中的保护效果。