一种尿液RNA保存液、尿液RNA提取试剂盒及PCA3、HOXC6、DLX1基因组合在前列腺癌早筛中的应用的制作方法

本发明涉及一种保存液，尤其涉及一种尿液rna保存液、尿液rna提取试剂盒及pca3、hoxc6、dlx1基因组合在前列腺癌早筛中的应用。

背景技术：

1、前列腺癌(prostate cancer，pca)是一种严重威胁男性健康的恶性肿瘤，我国pca的发病率平均每年增长4.7％，是增加最快的男性恶性肿瘤。目前前列腺癌筛查主要手段是血清psa检测，该方法需要采集患者血液，且psa检出阳性的人群里，经前列腺穿刺确诊的前列腺癌阳性人数占比不到30％，特异性较低。该检测方法致使许多患者接受了不必要的穿刺，给患者带来了痛苦和损失，因此亟需寻找一些新型标志物来辅助前列腺癌早期筛查。目前也有文献报道了一些新型的前列腺癌肿瘤标志物如pca3、dlx1等，但这些标志物的灵敏度和特异性普遍不高，且其检测样本多为经dre(直肠指诊)后采集的尿液，临床上患者对于dre的接受度较低，这也增大了样本采集的难度。而且相对于外周血，尿液样本的成分更加复杂，其中含有较多的核酸酶，会分解样本中的核酸，致使核酸含量严重降低，这也导致尿液样本往往需要低温保存和运输，且保存时间较短，增加了样本采集和运输的成本。市面上已有的尿液保存液，虽然能够保证尿液样本可以在常温条件下保存较长的时间，但其一次性能够处理的样本量较少，只能保存不到5ml的尿液样本，且保存尿液后需通过提取混合液获得rna，这不仅增加了提取的成本，而且获得的核酸含量也较低，给后续的pcr检测造成了困扰，因此需要开发一款适用于大体积尿液样本的保存液。另一方面，因为患者前列腺发生病变，其尿液样本中往往含有各种杂质，如前列腺液、不溶性的药物代谢产物等，同样的，尿液在存放的过程中，其各种理化性质也会发生改变，会析出一些尿酸盐、磷酸盐、碳酸盐等不溶性沉淀，导致尿液样本呈现浑浊样。目前市面上的rna提取试剂盒，多为传统的trizol法或者过滤柱法，其共同的特点就是需要将尿液进行高速离心，收集尿沉渣沉淀后提取尿沉渣中的rna，提取过程繁琐且耗时过长，提取效率很低。而且对于这些浑浊样的尿液样本，经过离心后，尿沉渣和不溶性的杂质会一起被离心下来，二者无法分离，就导致提取rna时，不溶性杂质会堵塞过滤柱或无法完全去除这些杂质，从而导致提取的核酸不纯或者提取失败，因此对于这种成分复杂的尿液样本，需要开发一款rna提取试剂盒，使得其可以分离尿液中的杂质，从而得到质量较好的rna样本，且操作简单，方便提取。

2、尿液是一种很不稳定的生物样本，一经排出，其理化性质就会发生改变，如ph可能升高或降低，析出尿酸盐或磷酸盐结晶等。随着存放时间的延长，尿液颜色会逐渐加深，内部有细菌繁殖导致尿液呈浑浊状，后续无法进行rna提取。且因为尿液中含有较多的核酸酶，导致样本中的rna会逐渐被降解，最终导致样本失效。因为尿液样本的复杂性，尿液样本的保存往往要求采集后立即低温保存与运输，方可一定程度上保证尿液样本的稳定性，但低温保存与运输，不仅使得样本的转运成本增加，而且低温往往会使得一部分尿液析出结晶沉淀，给后续的rna提取增加了困难。因此需要将尿液保存在尿液保存液中，保证尿液样本可以在常温条件下储存较长时间，且其中的rna不会被降解。目前已开发的尿液保存液，虽然可以保证尿液在常温条件下储存，但其性能远远无法满足需要。如专利“一种核酸保护试剂及其使用方法”中开发的核酸保护试剂，其在收集样本以后，需要将0.5-2倍样本体积的a液加入到样本中，固定10min后，再加入a液量3倍的b液后进行保存，这种核酸保护试剂不仅操作繁琐，不便于大规模采集与处理样本，且其一次性保存的尿液量相对较少。专利“尿液保存液、保存方法和尿液保存管”中开发的尿液保存液，其操作相对简便，可以保存较多量的尿液，但其仅能保证尿液样本在常温条件下稳定保存7天，保存时间相对较短，亦无法满足样本储存要求。

3、前列腺癌是一种进展非常缓慢的癌症，在前列腺癌早期，由于肿瘤起病较为隐匿，生长较为缓慢，所以大多数前列腺癌患者无明显症状，一旦前列腺癌开始快速生长或扩散到前列腺外，病情则比较严重，因此加强癌症筛查和早诊早治是提高前列腺癌生存率、降低死亡率的关键所在。目前临床上常用的前列腺癌筛查的手段主要是血清psa检测，但该检测方法的特异性较低，尤其是在灰区(4-10ng/ml)时，患者穿刺活检的阳性率只有10-25％。据统计全世界每年接受前列腺穿刺活检的人群中，其中75％以上是不必要的，穿刺活检会给患者带来许多并发症，如血尿、败血症、感染等，给患者带来极大的痛苦。虽然psa应用广泛，但也存在上述等较大问题，亟需新的检测靶标来弥补其缺陷。专利“尿液前列腺癌标志物组合及其在制备精准诊断试剂中的用途”中，公布了7个前列腺癌肿瘤标志物联用来进行前列腺癌大的早筛，7基因的联合检测，其敏感性与特异性可达到87.8％与78％，但是其检测实验步骤极其繁琐，耗时很长且检测项目较多，相应的检测成本也大大增加，不利于临床上大批量人群的筛查。专利“dlx1，hoxc6和pca3在制备前列腺癌标志物中的应用及其试剂盒”中，推荐使用dlx1、pca3与hoxc6这3个基因联合检测，也可达到较好的检测敏感性与特异性，但是其检测所使用的样本类型为经dre(直肠指诊)后采集的尿液，样本采集较为困难，且其pcr反应为两步法，操作步骤繁琐，耗时较长，同样不利于临床上大批量人群的筛查。

技术实现思路

1、本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种检测准确性和特异性较高，检验操作简单，成本较低，且可以用晨尿样本代替dre尿液尿液样本进行检测，减少了患者采样的痛苦，患者依从性好的一种尿液rna保存液、尿液rna提取试剂盒及pca3、hoxc6、dlx1基因组合在前列腺癌早筛中的应用。

2、本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

3、一种尿液rna保存液，其组份包括如下：异硫氰酸胍浓度为1m；peg8000浓度为质量分数20％；dtt浓度为60mm；triton x-100浓度为质量分数0.5％；tris-hcl(ph7-8)浓度为0.1m；depc浓度为0.1％。

4、一种尿液rna保存液的制备方法，按以下步骤进行：

5、(1)将1m的tris-hcl溶液加入水中，制备一定浓度的缓冲试剂a；tris-hcl的ph＝7-8；

6、(2)称取相应量的异硫氰酸胍、peg8000、dtt固体溶于上述溶液a中；量取相应体积的triton x-100、depc依次加入溶液a中，涡旋混匀，最后将溶液ph调整到7.0-8.0之间，用水定容，即得到相应浓度的尿液保存液；

7、一种尿液rna提取试剂盒裂解液，其组份包括如下：异硫氰酸胍浓度为3m；盐酸胍浓度为2m；dtt浓度为30mm；tris-hcl(ph8.0)浓度为1m；edta-2na(ph8.0)浓度为0.3m；tritonx-100浓度为质量分数1％；蛋白酶k浓度为0.2mg/ml；nacl浓度为0.2m。

8、一种尿液rna提取试剂盒裂解液的的制备方法，按以下步骤进行：

9、(1)称取相应量的tris-hcl置于纯化水中，搅拌至其完全溶解，并调节其ph至8.0，得到溶液a；

10、(2)称取相应量的edta-2na置于纯化水中，搅拌至其完全溶解，并调节其ph至8.0,得到溶液b；

11、(3)称取相应量的异硫氰酸胍、盐酸胍、dtt、nacl置于纯化水中，加热搅拌至其完全溶解，得到溶液c；

12、(4)取相应体积的溶液a、溶液b、tritonx-100、蛋白酶k置于上述溶液c中，搅拌均匀，即得到相应浓度的裂解液。

13、一种尿液rna的提取方法，尿液样本采集与保存操作步骤如下：

14、(1)取尿液保存液5ml置于50ml离心管中；

15、(2)患者使用尿杯收集尿液后，将尿液倒入上述已装有尿液保存液的50ml离心管中，旋紧管盖，上下颠倒混匀10次；

16、(3)尿液与尿液保存液混合后，可于常温条件下运输与保存，常温条件下可稳定保存12个月；

17、尿液rna提取试剂盒的提取操作步骤如下：

18、(1)取尿液样本10-50ml至50ml离心管中，4℃，12000g离心15min，弃上清；

19、(2)往尿沉渣中加入500ul裂解液，500ul异丙醇(ipa)，充分震荡重悬尿沉渣15s，转移至1.5ml离心管中；

20、(3)将步骤(2)中离心管放置在55℃的金属浴或水浴锅中裂解5min，然后室温裂解5min，期间每2min涡旋震荡5s；

21、(4)裂解结束后，3000g离心1min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入30ul磁珠，充分震荡混匀，室温静置5min，期间每2min涡旋震荡5s；

22、(5)将离心管插入磁力架上上下颠倒10次后静置吸磁1min，待磁珠完全吸附，用移液器吸去上清液；

23、(6)将离心管从磁力架取下，加入600μl清洗液(75％乙醇)，充分震荡重悬磁珠后，静置1min；

24、(7)将离心管插入磁力架上上下颠倒10次后静置吸磁1min，待磁珠完全吸附，用移液器吸去上清液；

25、(8)重复步骤(6)-(7)一次；

26、(9)室温开盖晾干3min；

27、(10)加入65℃预热的50μl洗脱液(无核酸酶水)，充分震荡分散磁珠，65℃温育5min，期间每2min涡旋震荡5s；

28、(11)将离心管在掌式离心机上瞬时离心3s，插入磁力架上静置吸磁1min，待磁珠完全吸附，用移液器转移上清液至新的离心管中，此即为提取得到的rna，可保存于-80℃。

29、尿液rna提取试剂盒的提取操作步骤中：步骤(2)中：对于量特别多或呈胶状的尿沉渣样本，可延长震荡时间，或增加裂解液使用量并分多管提取，以增加核酸产量；步骤(6)中，洗涤过程中，有些样品可能出现较严重的磁珠絮凝，建议使用移液器吹打或增加涡旋混匀的强度和时间，尽量打散磁珠；一般来说，磁珠絮凝说明样本中核酸量较大，大量染色质核酸吸附在磁珠表面，吸附过程顺利高效，只要充分打散团块就可以获得理想的核酸产量。

30、一种pca3、hoxc6、dlx1基因组合在前列腺癌早筛中的应用：

31、(1)pca3、hoxc6、dlx1及psa引物与探针序列如下：

32、名称：pca3-f引物序列(5‘-3’)：caaaaggaagcacagagatcc；

33、名称：pca3-r引物序列(5‘-3’)：tcctctcattggtaatgctca；

34、名称：pca3-p探针序列(5‘-3’)：fam-ccgccatcttgggtca-mgb；

35、名称：hoxc6-f引物序列(5‘-3’)：tggagctgagacaggctc；

36、名称：hoxc6-r引物序列(5‘-3’)：ctcggaactagatggttatcg；

37、名称：hoxc6-p探针序列(5‘-3’)：vic-cagcggcacagaatgaggga-mgb；

38、名称：dlx1-f引物序列(5‘-3’)：actcacacagactcaggtc；

39、名称：dlx1-r引物序列(5‘-3’)：gcactaccctccagag；

40、名称：dlx1-p探针序列(5‘-3’)：texas-red-acaagcgatccaagttcaaga-mgb；名称：psa-f引物序列(5‘-3’)：gcattgaaccagaggagttct；

41、名称：psa-r引物序列(5‘-3’)：cacagcatgaacttggtca；

42、名称：psa-p探针序列(5‘-3’)：cy5-tgacgtgtgtgcgcaag-mgb；

43、(2)rna提取：通过权利要求5所述的操作步骤对患者尿液样本进行rna提取，提取后的rna样本置于-80℃条件下储存；

44、(3)pcr检测：

45、3.1引物、探针混合液配制：

46、使用无核酸酶超纯水将各基因的引物、探针稀释至10μm，按以下配方配制引物、探针混合液：

47、pca3-f引物0.2μl；pca3-r引物0.2μl；pca3-p探针0.15μl；hoxc6-f引物0.1μl；hoxc6-r引物0.1μl；hoxc6-p探针0.1μl；dlx1-f引物0.2μl；dlx1-r引物0.2μl；dlx1-p探针0.15μl；psa-f引物0.15μl；psa-r引物0.15μl；psa-p探针0.15μl；无核酸酶超纯水1.15μl；

48、3.2pcr反应液配制：

49、按照以下的配方，配制pcr反应液；pcr扩增试剂选择诺唯赞厂家的accurstart u+one step rt-qpcr probe kit(for fast)，此外额外加入betaine来提高扩增反应的特异性；反应液配制完成后，按照15μl/管的分装量分装至八联pcr管中，之后加入模板rna 5μl，盖紧管盖，轻轻混合后，瞬时离心：

50、引物、探针混合液3μl；5x one step u+mix 4μl；one step u+enzyme mix 1μl；betaine 3μl；rna液5μl；无核酸酶超纯水4μl；

51、3.3pcr扩增：

52、将八联pcr管置于abi7500仪器内，设置好反应程序，反应条件如下：

53、逆转录的反应条件：55℃，15min；

54、预变性的反应条件：95℃，5min；

55、循环反应(45cycles)的反应条件：95℃，10s；或，60℃，30s；

56、(4)结果分析：

57、4.1基线和阈值设定：

58、abi 7500仪器结果分析时根据实际情况可将基线调整为3-15，手动设置阈值线，用户可根据实际情况调节阈值线至扩增曲线升起的拐点处，得到ct值。

59、5.2样本不合格排除标准：

60、①检测结果：psa的ct/cp值≥40.00或无s型曲线；判定结果：样本不合格，重新检测，仍不合格者，需重新取样后检测；

61、②检测结果：psa的ct/cp值＜40.00，且具有明显s型扩增曲线；判定结果：样本合格，进行下一步判定；

62、5.3阳性判断值：

63、根据pcr检测的结果，将dlx1、hoxc6、pca3及psa 4项检测结果输入以下公式计算dh-score；

64、结果计算公式如下：dh-score＝1/[1+e-(0.8026-0.158x+0.103y-0.179z)]，其中x为dlx1相对psa表达量，y为hoxc6相对psa表达量，e为自然数，-0.158、0.103和-0.179为加权计算系数,0.8026为常数系数；

65、x，y，z的计算方法如下：x＝ct(dlx1)-ct(psa)；y＝ct(hoxc6)-ct(psa)；z＝ct(pca3)-ct(psa)。

66、本发明公开了一种尿液保存液，该保存液可以保护尿液中rna不被降解，加入该保存液的尿液样本在常温条件下可稳定保存12个月。且该保存液可以保存几十至上百毫升的尿液样本，只需将混合液进行高速离心，收集尿沉渣，即可用于后续的rna提取，可以轻松处理几十至上百毫升尿液的单次提取，节约了提取的成本。而且使用该保存液以后，就可使用数倍体积的晨尿样本来代替传统的经dre(直肠指诊)后采集的尿液，患者接受度提高，方便了样本的采集。

67、本发明公开了一种尿液rna提取试剂盒，该提取试剂盒使用裂解液裂解尿沉渣中的细胞，从而释放细胞中的rna至上清液中，裂解完成后进行低速离心，即可将杂质沉淀与上清液进行分离。之后使用磁珠对上清液中的rna进行分离纯化，即可得到高质量的rna，且整个提取过程操作步骤简单，耗时很短，提取成本较低，大大提高了提取效率。

68、本发明公开了一种前列腺癌肿瘤标志物pca3、hoxc6、dlx1基因的组合，以psa基因作为内参，使用rt-pcr方法在晨尿样本中检测这三个基因的表达，从而辅助前列腺癌的早期诊断。使用晨尿样本代替经dre(直肠指诊)后采集的尿液，大大减少了样本采集的难度，减轻了病人的痛苦，患者依从性好。而且这三个基因的联合检测，其灵敏度为82.3％，特异性可达到86.5％，准确性和特异性均较高，为前列腺癌的早诊早治提供了一种安全、有效、便捷的诊断方法。

69、本发明所开发的尿液rna保存液，采样方便，用法简便，可轻松实现几十至上百毫升尿液的保存，且可保护尿液样本在常温条件下稳定保存，保护其中的rna不被降解，常温保存时间可达到12个月，保存时间较长。

70、2.本发明所开发的尿液rna提取试剂盒，操作简便，耗时较短，适合大批量样本的处理，且其可以轻松分离尿液中的各种不溶性杂质和结晶，排除了这些杂质对rna提取的干扰，可以获得较为纯净的rna，这也一定程度上方便了患者的采样，

71、3.本发明开发的pca3、hoxc6、dlx1基因联合检测用于前列腺癌早筛，检测准确性和特异性较高，检验操作简单，成本较低，且可以用晨尿样本代替dre尿液尿液样本进行检测，减少了患者采样的痛苦，患者依从性好。