一种甘蓝型油菜负调控抗旱耐盐基因BnUSDR定点突变的方法及应用

本发明属于植物基因编辑和植物育种，具体涉及提供了一种甘蓝型油菜负调控植物抗旱耐盐的bnusdr基因及通过cirspr/cas9系统定点突变bnusdr基因的方法及提高甘蓝型油菜抗旱耐盐的应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜属于十字花科芸苔属，是我国自产植物油的第一大油源，产油量占国产油料作物产油量的55％左右，是确保植物油供给的重要保障。然而目前油菜播种面积和产量小幅增长，消费量和贸易量持续增加，油菜籽供需形势总体偏紧。且随着农业产业结构的不断优化调整，油菜已由油用为主，逐渐发展成为兼能源、蔬菜、绿肥、饲料和观赏等多功能用途于一体的重要经济作物。油菜在农产品中占有重要地位，具有较大的发展潜力。

2、土壤盐碱化问题严重制约着农业的可持续发展，据不完全统计，我国盐碱地面积约为0.35亿公顷，占全球盐碱地面积的3.67％，土壤盐碱化仍呈现加重趋势。油菜属于中度耐盐碱植物，是盐碱地的开发和利用中的重要作物之一。且我国东北、西北、滨海、黄河中上游和黄淮海平原五大盐碱区和江苏沿海滩涂盐碱地的气候均适宜种植油菜。如能培育耐盐油菜品种，合理开发和利用盐碱土地资源种植油菜，将大幅提高我国的油料产能。油菜的适种范围广，目前种植的油菜中，80％为甘蓝型油菜。甘蓝型油菜相对于白菜型和荠菜型油菜产量较高，但对于干旱胁迫较为敏感，极易发生旱害。长江流域作为油菜的主产区，全年降水不均，易出现季节性干旱，降低油菜产量。因此，开展油菜抗逆研究，降低和预防干旱和盐碱胁迫对油菜的危害，选育抗旱和耐盐碱的油菜品种，不仅可以提高油菜的产量，也可以对土地资源进行更充分的利用，扩大油菜的种植面积，也是油菜产业发展的迫切需求，具有重要意义。

3、获得2020年诺贝尔化学奖的crispr(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)基因编辑敲除技术可以精确、快速的对农作物的目标基因进行编辑，不引入其它外源基因，与基于自然变异或诱变所育的作物品种相比并无区别，但却有着精准编辑、操作简单、耗时短和成本低的优点，大大提高了育种效率进而创造新种质，也成为多国争抢的育种技术新高地。甘蓝型油菜作为基因组较为复杂的异源四倍体作物，因其有较多的同源拷贝，且不同的同源拷贝间存在基因冗余现象。crispr/cas9系统定点突变技术因具有高效性和便捷性，且能够同时敲除多个基因，在增强植物抗逆性，植物遗传改良，解析植物基因功能以及提升作物品质等方面发挥了重要作用。因此寻找负调控植物耐盐和抗旱的调控基因，并采用crispr/cas9系统定点突变技术在油菜中进行创新育种，将具有重要应用前景。

4、小分子糖基转移酶ugts(plant secondary metabolite udp-dependentglycosyltransferases)作为一种酶，能催化udpg上的糖基转移到植物重要的信号小分子底物上，从而改变小分子的活性。ugts主要特征是含有一个保守元件pspg box(plantsecondary product glycosyltransferase box)。ugts蛋白家族在进化上非常保守，研究发现ugts可以糖基化aba、sa、ja等多种植物激素从而在植物的生长发育以及各种逆境胁迫中发挥着重要作用。

技术实现思路

1、针对以上技术问题，本发明提供了一种甘蓝型油菜负调控抗旱耐盐基因bnusdr定点突变的方法及应用；本发明通过比对发现了甘蓝型油菜负调控植物抗旱耐盐的bnusdr基因，并利用cirspr/cas9系统对甘蓝型油菜的bnusdr基因定点突变来育种，具体步骤为：根据bnusdr基因的保守区域设计特异靶向sgrna同时构建出双靶点的cirspr/cas9定点突变载体，并通过农杆菌介导转化入甘蓝型油菜y127使得该基因定点突变创制可抗旱和耐盐的新种质；本发明利用基因编辑技术敲除负调控抗旱耐盐的基因从而创制新种质，极大的提高了油菜育种效率和缩短了油菜育种周期，为抗旱耐盐的油菜育种提供新思路。

2、本发明所述bnusdr基因中，bn表示油菜英文简写，u、s、d和r分别为ugts、salt、drought和resistance的首字母。

3、为了达到上述目的，本发明采用以下技术手段：

4、本发明首先提供了bnusdr基因在调控甘蓝型油菜抗旱和/或耐盐中的应用，所述bnusdr基因包括bnusdr-c05和bnusdr-a10，所述bnusdr-c05的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列seq id no.2所示；

5、bnusdr-a10的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。

6、优选地，所述应用为：通过敲除或沉默bnusdr-c05和bnusdr-a10来提高甘蓝型油菜抗旱和/或耐盐的能力；优选采用基因定点突变来敲除或沉默bnusdr-c05和bnusdr-a10。

7、本发明还提供了一种用于上述甘蓝型油菜bnusdr基因定点突变的crispr/cas9系统序列元件组，所述序列元件组包括u6-26p-target1-grna、u6-26p-target2-grna和根据密码子优化后的cas9基因；

8、所述u6-26p-target1-grna包括启动子u6-26p，grna骨架结构和target1；

9、所述u6-26p-target2-grna包括启动子u6-26p，grna骨架结构，target2；

10、所述甘蓝型油菜bnusdr基因包括bnusdr-c05和bnusdr-a10，所述target1和target2为基因bnusdr-c05和bnusdr-a10的靶点序列；

11、所述target1的核苷酸序列为：5’-cccggagatccaagacccgc-3’(seq id no.5)；

12、所述target2的核苷酸序列为：5’-tgttccggctaaggttctgc-3’(seq id no.6)；

13、所述sgrna的核苷酸序列为：gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggcta gtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(seq id no.7)。

14、本发明中还提供了一种基因编辑载体pkse401-bnusdr-crispr，所述基因编辑载体包含上述用于甘蓝型油菜bnusdr基因定点突变的crispr/cas9系统序列元件组。

15、本发明中还提供了用于甘蓝型油菜bnusdr基因定点突变的基因工程菌，所述基因工程菌采用上述基因编辑载体pkse401-bnusdr-crispr转化宿主细菌得到。

16、本发明中还提供了一种用于甘蓝型油菜bnusdr基因定点突变的试剂盒，所述试剂盒包含上述基因编辑载体或基因工程菌。

17、本发明中还提供了上述序列元件组、基因编辑载体pkse401-bnusdr-crispr、基因工程菌或试剂盒的应用，所述应用包括：

18、(a)在上述甘蓝型油菜基因bnusdr-c05和/或基因bnusdr-a10定点突变中的应用；

19、(b)在具有抗盐、耐旱的甘蓝型油菜育种中的应用；和/或

20、(c)在具有提高盐和干旱条件下产量的甘蓝型油菜育种中的应用。

21、本发明中还提供了一种利用cirspr/cas9系统对甘蓝型油菜bnusdr基因定点突变的方法，包括：

22、(1)针对甘蓝型油菜中的bnusdr基因设计筛选靶点target1和target2，并设计sgrna序列，将2个靶点target1和target2分别与sgrna序列连接，构建出双靶点基因编辑载体pkse401-bnusdr-crispr；

23、(2)将基因编辑载体pkse401-bnusdr-crispr转化农杆菌gv3101，得到含有基因编辑表达载体pkse401-bnusdr-crispr的农杆菌；

24、(3)扩大培养，将pkse401-bnusdr-crispr载体通过农杆菌介导法转入油菜下胚轴；

25、(4)油菜下胚轴培养、诱导愈伤组织、再分化、生根培养、炼苗、移栽，得到转基因油菜；

26、(5)鉴定获得bnusdr基因发生突变的转基因植株；

27、所述target1的核苷酸序列如seq id no.5所示，

28、所述target2的核苷酸序列如seq id no.6所示，

29、所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.7所示。

30、优选地，所述target1和target2为基因bnusdr-c05和bnusdr-a10的靶点序列。

31、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

32、脱落酸(abscisic acid，aba)是一种重要的植物激素，在植物抗旱和耐盐的逆境胁迫中发挥了重要作用。拟南芥小分子糖基转移酶ugts中的ugt71c5能够糖基化aba，因此使得发挥抗旱和耐盐的aba失去活性，从而负调控拟南芥的抗旱和耐盐性。

33、本发明将甘蓝型油菜与拟南芥ugt71c5进行同源比对，获得了与拟南芥最为相近的两个基因bnusdr-a10和bnusdr-c05，通过测序发现，两个基因均具有ugts的保守原件pspg box。本发明首次利用cirspr/cas9系统对油菜ugts bnusdr-a10和bnusdr-c05基因进行定点突变，获得了抗旱、耐盐的油菜种质。本发明创建的新种质在能够耐受为期27天的干旱以及高达600mm的nacl，因此该种质能够同时具备抗旱和耐盐两种抗逆特性，相比于只具备抗旱或耐盐一种抗性的种质更具推广价值。

34、本发明选用的两个靶点target 1和target 2均能同时靶向bnusdr-a10和bnusdr-c05两个基因，且靶点靶向序列均在糖基转移酶保守原件pspg box前面。这样保证了两个靶点中target 1和target 2任意一个发挥功能或同时发挥功能均可能在bnusdr-a10和bnusdr-c05两个基因上同时产生位于保守原件pspg box前面的碱基修饰，从而挑选出导致这两个基因同时丧失功能的碱基修饰。因此，两个靶点target 1和target 2的选择保证了bnusdr-a10和bnusdr-c05的同时被敲除。

35、本发明发现了一种能负调控甘蓝型油菜抗旱和耐盐的基因bnusdr，通过构建该基因的crispr基因编辑载体并转化甘蓝型油菜y127，使得该基因成功被敲除，从而提高了油菜的抗旱和耐盐性。本发明构建的基因编辑载体pkse401-bnusdr-crispr转化油菜后获得的转化株，为研究基因bnusdr的功能及作用机制提供了实验材料，也可作为新的抗旱、耐盐种质资源，本发明在油菜的抗旱和耐盐育种方面具有广泛的应用前景。