一种从头合成对香豆酰乙酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

本发明涉及合成生物学和代谢工程领域，具体涉及一种从头合成对香豆酰乙酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、对香豆酰乙酸作为重要有机合成中间体佳味酚和异佳味酚的前体物质，目前尚无对香豆酰乙酸的生物合成方法，但其前体物质对香豆醇的合成途径已有研究。以葡萄糖为底物合成对香豆醇是从大肠杆菌的天然代谢物l-酪氨酸延伸而来，l-酪氨酸被l-酪氨酸氨解酶(tal)脱氨生成对香豆酸，在对香豆酸-辅酶a连接酶(4cl)的催化下对香豆酸与辅酶a连接为对香豆酰辅酶a，随后被肉桂酰辅酶a还原酶(ccr)和肉桂醇脱氢酶(cad)还原为对香豆醇。van等人[van summeren-wesenhagen p v,voges r,dennig a,et al.combinatorialoptimization of synthetic operons for the microbial production of p-coumarylalcohol with escherichia coli[j].microbial cell factories,2015,14:1-10]通过对途径中各个模块的操纵子进行改造来调控各个基因的表达，最终对香豆醇的产量提高至52mg/l。筛选不同来源的高催化活性酶和对已有酶进行改造是提高目标产物合成途径代谢流的常用策略。chen等人[chen z,sun x,li y,et al.metabolic engineering ofescherichia coli for microbial synthesis of monolignols[j].metabolicengineering,2017,39:102-109]通过检索文献和酶数据库，选择了来源rhodobacterglutinis的tal、来源arabidopsis thaliana的4cl、来源leucaena leucocephala的ccr和来源saccharomyces cerevisiae的醇脱氢酶adh6，使对香豆醇的产量提高到501.8±41.4mg/l。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种从头合成对香豆酰乙酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从头合成对香豆酰乙酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。具体技术方案如下：

3、一种从头合成对香豆酰乙酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了酪氨酸氨基裂合酶基因、对香豆酸-辅酶a连接酶基因、肉桂酰-辅酶a还原酶基因和醇酰基转移酶基因。优选地，所述的从头合成，以葡萄糖为底物合成对香豆酰乙酸。

4、其中，所述的酪氨酸氨基裂合酶基因为来源于粘红酵母rhodotorula glutinis的酪氨酸氨基裂合酶基因rgtal；优选地，所述的rgtal的核苷酸序列如seq id no.8所示。

5、所述的对香豆酸-辅酶a连接酶基因为来源于petroselinum crispum的对香豆酸-辅酶a连接酶基因4cl。优选地，所述的4cl的核苷酸序列如seq id no.7所示。

6、所述的肉桂酰-辅酶a还原酶基因，选自下述a1-a3中的一种或几种的组合：

7、a1，来源于银合欢leucaena leucocephala的llccr；优选地，所述的llccr的核苷酸序列如seq idno.4所示。a2，来源于玉蜀黍zea mays的zmccr；优选地，所述的zmccr的核苷酸序列如seq id no.5所示。a3，来源于拟南芥arabidopsis thaliana的atccr。优选地，所述的atccr的核苷酸序列如seq id no.6所示。

8、所述的肉桂酰-辅酶a还原酶基因更优选为核苷酸序列如seq id no.6所示的atccr。

9、其中，所述的醇酰基转移酶基因，选自下述b1-b6中的任意一种或多种的组合：

10、b1，来源于petunia hybrida的phcfat；优选地，所述的phcfat的核苷酸序列如seqid no.9所示。b2，来源于schisandra chinensis的sccfat；优选地，所述的sccfat的核苷酸序列如seq id no.10所示。b3，来源于malus domestica的mdaat1-rga；优选地，所述的mdaat1-rga的核苷酸序列如seq id no.11所示。b4，来源于fragaria ananassa的saat；优选地，所述的saat的核苷酸序列如seq id no.12所示。b5，来源于solanum lycopersicum的slaat1；优选地，所述的slaat1的核苷酸序列如seq id no.13所示。b6，来源于larreatridentata的ltcaat1；优选地，所述的ltcaat1的核苷酸序列如seq id no.14所示。优选为核苷酸序列如seq id no.10所示的sccfat。

11、其中，所述的重组大肠杆菌的出发菌株为l-酪氨酸生产菌株；优选为在大肠杆菌bl21中敲除了编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(cm-pdt)的基因phea、编码邻氨基苯甲酸合酶的基因trpe和编码全局性调控蛋白的基因tyrr的大肠杆菌bl21-δaer。更优选地，所述的基因phea的核苷酸序列如seq id no.1；所述的基因trpe的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述的tyrr的核苷酸序列如seq id no.3所示。

12、其中，所述的重组大肠杆菌同时表达了酪氨酸氨基裂合酶基因、对香豆酸-辅酶a连接酶基因、肉桂酰-辅酶a还原酶基因和醇酰基转移酶基因；所述酪氨酸氨基裂合酶基因为来源于粘红酵母rhodotorula glutinis的rgtal；所述对香豆酸-辅酶a连接酶基因为来源于petroselinum crispum的4cl；所述肉桂酰-辅酶a还原酶基因为来源于拟南芥arabidopsis thaliana的atccr；所述醇酰基转移酶基因为来源于schisandra chinensis的sccfat。优选地，所述的rgtal的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述的4cl的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述的atccr的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述的sccfat的核苷酸序列如seq id no.10所示。

13、本发明还提供了第一方面所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，将所述的酪氨酸氨基裂合酶基因、对香豆酸-辅酶a连接酶基因、肉桂酰-辅酶a还原酶基因和醇酰基转移酶基因克隆至质粒表达载体得到重组表达载体；将所述的重组表达载体导入l-酪氨酸生产菌株，即得。

14、所述的质粒表达载体，包括pet28a(pb)n或pacm4中的任意一种或两种。优选为pet28a(pb)n。优选地，所述的l-酪氨酸生产菌株为在大肠杆菌bl21中敲除了编码分支酸变位酶和预苯酸脱水酶(cm-pdt)的基因phea、编码邻氨基苯甲酸合酶的基因trpe和编码全局性调控蛋白的基因tyrr的大肠杆菌bl21-δaer。

15、本发明还提供了第一方面所述的重组大肠杆菌在发酵生产对香豆酰乙酸中的应用。

16、优选地，所述的发酵，将重组大肠杆菌接种至发酵培养基中30-37℃发酵36h即得。

17、有益效果：

18、本发明提供了一种以葡萄糖为底物的对香豆酰乙酸的生物从头合成路线，以大肠杆菌为底盘细胞，异源表达来源于rhodotorula glutinis的酪氨酸氨基裂合酶rgtal和来源于petroselinumcrispum的对香豆酸-辅酶a连接酶4cl，并筛选了不同来源的肉桂酰-辅酶a还原酶(ccr)和醇酰基转移酶(松柏醇酰基转移酶cfat或醇酰基转移酶aat)，在cfat/aat的作用下，乙酰基辅酶a上的乙酰基被转移到对香豆醇的羟基上，可生成对香豆酰乙酸和游离辅酶a。使用质粒pet28a(pb)n共表达上述酶，随后转入敲除phea、trpe、tyrr的三敲除大肠杆菌bl21(de3)中，构建出以葡萄糖为底物，从头合成对香豆酰乙酸的重组大肠杆菌。本发明构建得到的重组大肠杆菌bl21-δaer/sccfat，以葡萄糖为底物发酵36h可以成功合成70mg/l的对香豆酰乙酸。