灌注生物反应器及相关使用方法与流程

【】相关申请案之交互参照本专利申请案是于35u.s.c.§119之下要求2017年10月16日申请的美国临时专利申请案号62/572,918u.s之利益，其全文以引用的方式并入本文中。本公开涉及灌注生物反应器及相关使用方法。【先前技术】生物反应器可就制造生物性产物，例如蛋白之目的，用于维持细胞培养。在一馈料批式反应器中，在培养期间将一或多种营养素给料至生物反应中，而生物产物留在生物反应器直到该批次结束。灌注生物反应器应付某些与馈料批式相关的效能挑战，并在1990年后期开始普及。然而，最新技术的灌注生物反应器遭逢可用的控制策略数目有限、数据空缺和费用高之苦。例如，当在应付泵漂移和程序变异性时，灌注反应器的控制解决方案试图校正输入和输出给料泵的体积流量。然而，由于任二个特定泵间的固有差别(例如制造差异)和不能达到紧密控制，失败的生产运作可能导致填料过满或生物器排空。现有的控制解决方案亦缺乏测量其他参数，例如氨、葡萄糖和蛋白属性之能力。本公开之实施例解决一或多个现有灌注生物反应器之限制和缺点。

背景技术：

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本公开之实施例，除了其他事项外，是关于一种控制生物反应器和生物反应器系统之方法，其可用于控制蛋白生产之细胞培养程序。文中所揭示的各实施例可包括一或多个与任何其他实施例有关之文中所述的特点。

2、本公开是关于一种控制生物反应器系统之方法，其包括提供一生物反应器中的细胞培养物；藉由拉曼探针(raman probe)测量细胞反应器内之细胞培养物的一或多项工艺参数；使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基；使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞；使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中；及以拉曼探针测量为基准，改变一或多项第一特定比率、第二特定比率或第三特定比率。

3、本公开一实施例是关于一种控制生物反应器系统之方法，其包括：提供一生物反应器中的细胞培养物，其中生物反应器中的条件能让细胞培养物产生感兴趣蛋白(poi)，以拉曼测量生物反应器内细胞培养物的工艺参数(pp)，其中该工艺参数是由营养素浓度、活细胞浓度和蛋白属性组成之群中选出，测量含细胞培养内容物的生物反应器重量，使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞之用过的培养基，使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞，及使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中，且其中该输入和输出导管以拉曼探针测量值及生物反应器的重量测量值为基准加以调整用以维持(i)一或多项工艺参数在预定的范围内，(ii)含细胞培养物之生物反应器重量在预定的范围内，及(iii)输入导管的第三特定比率以及各输出导管的第一和第二特定比率在各自的预定范围内。

4、在某些实施例中，以拉曼测量生物反应器内培养的一或多项工艺参数以规律的间隔进行，例如至少每小时一次。在其他的实施例中，该方法配置为将细胞培养物以稳定状态维持在每毫升(ml)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时至少约30天。在一实施例中，此生物反应器具有至少2l，至少3l，至少10l，至少35l，或至少50l，或更高的容积，且该方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的生物反应器重量之0.1百分比。例如此生物反应器具有至少约10l之容积，而该方法配置为将生物反应器和细胞培养物之重量维持在以最初的生物反应器和细胞培养物内容物重量为基准所测定的重量范围内，例如在约20±2g范围内。在某些实施例中，当工艺参数偏离各自所欲范围内的设定值时，则控制一或多项移出无细胞培养物基，移出细胞和导入新鲜培养基或营养素或二者及然后调整生物反应器，用以降低偏差。每天经由第一输出导管移出至少二个生物反应器体积的用过培养基。每天经由第一输出导管移出至高三个生物反应器体积的用过培养基。工艺参数包括细胞培养物的温度和细胞培养物的ph，且温度维持在约30至40℃，约32至约38℃或34至约38℃，而ph维持从在6.50至约7.50，从约6.60至约7.40，从约6.70至约7.40，从约6.80至约7.30，从约6.90至约7.20，从约7.00至约7.10，约6.50，约6.55，约6.60，约6.65，约6.70，约6.75，约6.80，约6.85，约6.90，约6.95，约7.00，约7.05，约7.10，约7.15，约7.20，约7.25，约7.30，约7.35，约7.40，约7.45，或约7.50。工艺参数包括细胞单位生产率，且该方法配置为将细胞培养物内的细胞维持在至少约15-60pg/细胞/天，约15-25pg/细胞/天，至少约17-23pg/细胞/天，或至少约19-21pg/细胞/天的细胞单位生产率历时至少25-37天。工艺参数包括葡萄糖浓度，且该方法配置为将葡萄糖浓度维持在从约5mm至约85mm，或从约0.5g/l至约15.5g/l，从约1g/l至约15.5g/l，从约0.5g/l至约8g/l，从约2g/l至约6g/l，或从约3g/l至约5g/l。工艺参数包括乳酸浓度，且该方法配置为将乳酸浓度维持在低于约60mm，或低于约6g/l，低于约5g/l，低于约4g/l，低于约3g/l，低于约2g/l，或低于约1g/l。工艺参数包括氨浓度，且该方法配置为将氨浓度维持在低于约15mm，低于约12mm，低于约10mm，低于约9mm，低于约8mm，低于约7mm，低于约6mm。各移出无细胞用过的培养基、移出细胞和导入新鲜培养基或营养素或二者藉由各自的泵来控制。此生物反应器包括一配置用来保留细胞及让液体通过的过滤器。

5、在另外的实施例中，本公开是关于控制生物反应器系统之方法，其包括提供一生物反应器中的细胞培养物；以拉曼探针测量一或多个生物反应器内细胞培养物的工艺参数(pp)；及以拉曼探针的测量值为基准，调整一或多项生物反应器的输入和输出。

6、根据本公开之方法以包括下列步骤加以说明：提供一生物反应器中的细胞培养物(302)，其中生物反应器中的条件能让细胞培养物产生感兴趣蛋白(poi)，以拉曼测量生物反应器内培养的工艺参数(304)，其中该工艺参数是由营养素浓度、活细胞浓度和蛋白属性组成之群中选出，测量含细胞培养物的生物反应器预定重量(306)，使用第一输出导管以第一特定比率从细胞培养物移出无细胞用过的培养基(308)，使用第二输出导管以第二特定比率从细胞培养物移出细胞(310)，及使用输入导管以第三比率将新鲜培养基或营养素或二者导入细胞培养物中，且其中该输入和输出导管以拉曼探针测量值及生物反应器的重量测量值为基准加以调整以维持(i)一或多项工艺参数在预定的范围内，(ii)含细胞培养物之生物反应器重量在预定的范围内，及(iii)输入导管的第三特定比率以及各输出导管的第一和第二特定比率在其各自的预定范围内(312)。

7、又在另外方面，本公开关于一生物反应器系统，其包括具有输入导管和至少一输出导管之罐；至少一泵；联接此罐之过滤器；连接罐之拉曼探针；与至少一泵和拉曼探针连接之控制器，此控制器配置为以拉曼探针的输入值为基准，控制该至少一泵。

8、至少一输出导管包括用来连接第二泵之第一输出导管，而该第二泵配置用来控制从罐移出液体，以及用于连接第三泵的第二输出导管，而该第三泵配置用来控制从罐移出细胞。过滤器配置用来将细胞保留在罐内并让液体通过过滤器。拉曼探针配置在罐内。控制器与第一泵、第二泵和第三泵连接。生物反应器包括配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤；其中控制器配置来接收秤的重量数据。此控制器配置来比较重量设定点之罐重量，及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出。控制器配置用来接收来自拉曼探针之光谱数据；以接收的光谱数据为基准，测定细胞培养物的参数；将测定出的参数与设定点的参数相比较；及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出。调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出降低测出的参数和设定点参数之间的偏差，或接收的重量和设定点重量之间的偏差。此方法配置用来将细胞培养物以稳定状态维持在至少每毫升3千万个细胞之平均活细胞浓度历时30天。此罐具有至少10l的体积，且此方法配置为将含细胞培养物的罐之重量维持在20g范围内。此罐具有至少10l的体积，且此方法配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的罐重量之0.1百分比。控制器配置用来以接收的光谱数据为基准，测定多个生物反应器培养的参数；将各多个参数与各多个参数的各自设定点比较；及以该比较为基准，调整第一泵、第二泵和第三泵的一或多项输出，用以降低测定参数和各自设定值之间的偏差。多个参数包括温度、ph、营养素浓度、乳酸浓度、氨浓度和细胞单位生产率。过滤器配置用来保留细胞并让液体通过。生物反应器包括秤，其中该罐和过滤器置于秤上。生物反应器包括秤，其中该罐置于秤上。生物反应器包括秤，其中该罐与该秤实体接触。

9、一生物反应器培养系统，其包括：具有输入导管和至少一输出导管之罐；至少一泵；与罐接触之过滤器；连接罐之拉曼探针；与罐接触之秤；及联接至少一泵、秤和raman探针之控制器。在某些实施例中，过滤器和罐与秤接触。在另外的实施例中，过滤器包括网类物质。在某些实施例中，过滤器包括具有范围从0.2μm至30μm之孔洞大小的网子。

10、又在另外的实施例中，本公开关于一生物反应器系统，其包括：具有输入导管和至少一输出导管之罐；至少一泵；联接罐之过滤器；和罐接触之秤；联接罐之拉曼探针；及联接该至少一泵、秤和拉曼探针之控制器，而该控制器配置为以拉曼探针之输入和秤的输入为基准，控制该至少一泵。

11、在另外的实施例中，揭示一生物反应器培养系统。此生物反应器培养系统包括：具有供连接第一泵之输入导管、供连接第二泵之第一输出导管，以及供连接第三泵之第二输出导管的罐，而该第一泵配置用来控制液体递送到罐，第二泵配置用来控制从罐移出液体，第三泵配置用来控制从罐移出细胞；联接罐之过滤器，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐中并让液体通过过滤器；配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤；配置在罐内的拉曼探针。此实施例包括联接第一泵、第二泵、第三泵、秤和拉曼探针之控制器，其中控制器配置用来接收秤的重量数据，将罐的重量与设定点的重量相比较，接收来自拉曼探针的光谱数据，以接收的光谱为基准测定细胞培养物的参数，将测定地参数与设定点的参数相比，并以该比较为基准，调整一或多项第一泵、第二泵和第三泵的流通量。

12、调整一或多个第一泵、第二泵和第三泵的流通量降低所测之参数和设定点参数之间的偏差，或接收重量和设定点重量之间的偏差。此控制配置为将细胞培养物以稳定状态维持在每毫升(ml)至少约3千万个细胞之平均活细胞浓度历时约30天。此罐具有至少3l的体积，且此控制器配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在20g范围内。此罐具有至少3l的体积，且此控制器配置为将含细胞培养物的生物反应器重量维持在最初含细胞培养物的罐重量之0.1百分比。此控制器配置用来以接收的光谱数据为基准，测定多个生物反应器培养的参数；将各多个参数与各多个参数的各自设定点比较，及以该比较为基准，调整一或多个第一泵、第二泵和第三泵的流通量，用以降低测定参数和各自设定值之间的偏差。多个参数包括温度、ph、营养素浓度、乳酸浓度、氨浓度和细胞单位生产率。此生物反应器系统包括一过滤器配置用来保留细胞并让液体通过。罐和过滤器置于秤上。该罐置于秤上。

13、在特定的实施例中，根据本公开之生物反应器培养系统是以包括下列组件来说明：具有一供连接第一泵(30)之输入导管、一供连接第二泵(40)之第一输出导管，以及一供连接第三泵之第三输出导管的罐(10)，而该第一泵配置用来控制液体递送到罐，第二泵配置用来控制从罐移出液体，第三泵配置用来控制从罐移出细胞；一联接、连接罐或与罐液体连通之过滤器(100)，其中该过滤器配置用来将细胞保留在罐中并让液体通过过滤器；一配置用来测量罐内含有细胞培养物之罐重量的秤(110)；一配置在罐内的拉曼探针(18)；及一联接第一泵(30)、第二泵(40)、第三泵(50)、秤(110)和拉曼探针(18)之控制器(200)。

14、在此生物反应器培养系统中，控制器(200)配置为：接收秤(110)的重量数据；比较罐(10)重量与设定点的重量；接收拉曼探针(18)的光谱数据；以所接收的光谱数据为基准，测定细胞培养物参数；比较所测定的参数和设定点的参数；及以该比较为基准，调整一或多个第一泵、第二泵和第三泵的流通量。

15、【附图简单说明】

16、并入及构成本说明书之一部份的附图、说明的各种实例和描述共同用于解释所揭示的实例和实施例之原理。

17、本公开之各方面可结合附图所说明之实施例来施行。这些图显示本公开之不同的方面且，在适当情况下，说明如结构、组份、物质及/或组件之标号经同样标示。请了解，结构、组份及/或组件的各种组合，特别指出的除外，涵盖及在本公开之范围内。

18、再者，文中有许多描述和说明的实施例。本公开并非限制于任何单一方面及其实施例，亦非限制于此等方面及/或实施例的任何组合及/或排列。再者，本公开的各方面及/或其实施例，可单独或与一或多个本公开之其他方面及/或其实施例组合应用。为了简洁起见，文中并未各自论述及/或说明特定的排列和组合。请注意，描述为“例示的”之文中所述的实施例或施行不应理解为较佳的或优于，例如，其他实施例或施行，而是希望反应或指出该(等)实施例为“例示的”实施例。

19、图1为根据本公开之实例，生物反应器系统之示意图。

20、图2为图1之生物反应器系统的例示控制器示意图，及其各自输入和输出。

21、图3为一根据本公开之例示方法的流程图。

22、图4为比较一批第37天时灌注生物反应器中所测的活细胞浓度与一批第6天时馈料批式生物反应器中活细胞浓度之图示。

23、图5为显示有关图4所描述之灌注生物反应器和馈料批式生物反应器间随时间变化的正常化单位细胞生产率之图。

24、图6为显示未控制活细胞浓度和葡萄糖之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

25、图7为显示图6中所述之灌注生物反应器中随时间变化的葡萄糖浓度之图。

26、图8为显示图6中所述之灌注生物反应器中随时间变化的细胞存活率之图。

27、图9为显示控制活细胞浓度之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

28、图10为显示图9中所述之灌注生物反应器中稳定状态的细胞存活率之图。

29、图11为显示图9中所述之灌注生物反应器中随时间变化的正常化蛋白生产(效价)之图。

30、图12为显示图9中所述之灌注生物反应器中随时间变化的葡萄糖浓度之图。

31、图13为比较灌注生物反应器和馈料批式生物反应器之活细胞浓度之图。

32、图14为比较图13中所述之生物反应器中达到的正常化蛋白生产(效价)之图。

33、图15为显示使用拉曼探针控制活细胞浓度之灌注生物反应器随时间变化的活细胞浓度之图。

34、图16为显示图15中所述之灌注生物反应器中随时间变化的细胞存活率之图。

35、图17为显示图15中所述之灌注生物反应器中随时间变化的正常化蛋白生产(效价)之图。

36、图18为显示图15中所述之灌注生物反应器中随时间变化的葡萄糖浓度之图。

37、图19为显示使用拉曼探针控制活细胞浓度之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

38、图20为显示图19中所述之灌注生物反应器中随时间变化的正常化蛋白生产(效价)之图。

39、图21为显示使用拉曼探针控制活细胞浓度之灌注生物反应器中随时间变化的活细胞浓度之图。

40、再次，文中有许多描述和说明的实施例。本公开并非限制于任何单一方面及其实施例，亦非限制于此等方面及/或实施例的任何组合及/或排列。本公开的各方面及/或其实施例，可单独或与一或多个本公开之其他方面及/或其实施例组合应用。为了简洁起见，文中并未各自论述许多的该等排列和组合。

41、请注意，为了简单和清楚说明，特定的附图方面描绘各种实施例之一般结构及/或建构方式。熟知的特征及技术之说明和详情可能省略以避免不必要掩盖其他特征。附图中的组件并不一定按照比例；某些特征之尺寸相对于其他组件可能夸大，用以增进对示例实施例的了解。例如，本项技术之一般技术者应了解，剖视图并非按照比例且不应视为代表不同组件间的比例关系。剖视图提供用来帮助说明所述组合体之各种组件，及显示彼此的相对位置。