环状RNA及其m6A甲基化修饰的应用

本发明属于糖尿病诊断和治疗，具体涉及一种环状rna及其m6a甲基化修饰的应用。

背景技术：

1、1型糖尿病（t1d）是遗传易感基因和环境因素相互作用，诱发免疫攻击破坏胰岛β细胞，导致胰岛素绝对缺乏的自身免疫性疾病。t1d患者的血糖达标率低，并发症多且重，给病人带来健康与经济上的双重打击。t1d发病机制复杂，涉及遗传、环境、免疫等多个关键环节。目前，遗传易感基因和环境因素相互作用诱发免疫攻击破坏胰岛β细胞的关键调控机制尚不清楚，这一现状严重阻碍了对t1d的早期诊断、治疗药物的开发和精准干预的开展，给糖尿病管理带来巨大的挑战。

2、circrna是一种新型非编码rna，无5’端和3’端，而是通过共价键形成的一类具有闭合结构的rna分子。circrna的结构稳定，并具有多种生物学功能，研究表明，circrna诱导的基因表达调节在免疫系统中起着重要作用，这与自身免疫性疾病的发生和发展密切相关。m6a修饰是非编码rna产生和发挥功能的重要调节因子。

3、综上，circrna的m6a甲基化修饰在t1d中的作用研究有非常大的探索空间，本发明旨在探讨circrna m6a甲基化修饰在t1d中的作用，有望为t1d的早期诊断提供新的分子标志物，或阐明新的调控通路以及寻找潜在治疗靶点，对寻求新的从根本上攻克t1d的预防、早期诊断和治疗方法具有重要价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种环状rna及其m6a甲基化修饰的应用，以解决背景技术中提出的寻求新的从根本上攻克1型糖尿病的预防、早期诊断和治疗方法的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了环状rna作为1型糖尿病的生物标志物在制备诊断试剂盒中的应用，所述的环状rna为hsa_circrna_005995。

3、hsa_circrna_005995序列为：

4、gcaaaatcctgacagatgactttgcagacaaggagggtctggaaatgggtgatgagtactttgcaaatctggaccatatcgagagcgtggagaacttcaaagaaggatatgagagtgatgccccctgttcctctgacagcagtggtgtagacttgaaggaccaggaagatggcaacagcggtacagaggaccctgaagagtccaatgatgatagctcagatgataacttctgtaaggatgaggacttcagcaccagttcagtgtggcggagctatgctacccggaggcagacccggggccagaaagagaacggactctctgagacaacttccaaggactcccaccccccagatcttggacccccacatattcctgttcctccctcaatccctgtaggtggctgcaatccaccttcctccgaagagacacccaagaacaaggtggcctcatggttgagctgcaatagtgtcagtgaaggtggttttgctgactctgatagccattcatccttcaagactaatgaaggtggggagggccgggctgggggaagccgaatggaggctgagaaggcctccacctcaggactaggcatcaaggatgagggagacatcaaacaggccaagaaagaggacactgacgaccgaaacaagatgtcagt。

5、本发明还提供了检测环状rna的试剂在制备1型糖尿病诊断制剂中的应用，所述的环状rna为hsa_circrna_005995。

6、本发明还提供了一种1型糖尿病诊断制剂，含有检测环状rna hsa_circrna_005995的试剂。

7、本发明还提供了过表达hsa_circrna_005995的试剂在制备治疗1型糖尿病药物中的应用。

8、本发明还提供了治疗1型糖尿病药物，是过表达hsa_circrna_005995的试剂。

9、本发明还提供了环状rna的m6a甲基化修饰作为1型糖尿病的生物标志物在制备诊断试剂盒中的应用，所述环状rna的m6a甲基化修饰中的环状rna为hsa_circrna_005995。

10、本发明还提供了检测环状rna的m6a甲基化修饰的试剂在制备1型糖尿病诊断制剂中的应用，所述环状rna的m6a甲基化修饰中的环状rna为hsa_circrna_005995。

11、本发明还提供了一种1型糖尿病诊断制剂，含有检测环状rna hsa_circrna_005995的m6a甲基化修饰的试剂。

12、本发明还提供了过表达hsa_circrna_005995的m6a甲基化修饰的试剂在制备治疗1型糖尿病药物中的应用。

13、本发明还提供了治疗1型糖尿病药物，是过表达hsa_circrna_005995的m6a甲基化修饰的试剂。

14、相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：

15、本发明对从根本上攻克t1d的预防、早期诊断和治疗方法具有重要价值。

16、本发明收集了36例t1d患者和36例葡萄糖耐量正常对照者的外周血提取外周血单个核细胞（pbmc），抽提rna，采用人arraystar m6a-circrna表观转录组芯片检测，arraystar m6a-circrna芯片结果显示，与正常对照组相比，t1d组中有m6a差异的circrna共有11779个，经过筛选p<0.05且fc≥1.5的共有428个，其中，17个显著上调，411个显著下调。由于差异的circrnas数量过多，筛选差异倍数最为显著的28个m6a-circrnas制成了热图，以此预测有m6a差异的circrna在t1d发生、发展中的作用。

17、初步验证：与正常对照组相比，t1d中hsa_circrna_005995（p<0.01）m6a水平显著降低；进一步使用32例t1d和42例正常对照进行实时定量荧光pcr（qrt-pcr）验证，结果显示，与正常对照相比，t1d中hsa_circrna_005995表达量明显下降（p<0.001）。

18、本发明明确了hsa_circrna_005995在pbmcs各细胞成分中的表达情况。首先，通过磁珠分选法分选5个正常对照pbmcs中的cd4+t、cd8+t、cd14+单核、及cd19+b细胞，抽提rna并通过qrt-pcr检测hsa_circrna_005995在上述免疫细胞中的表达水平，结果显示hsa_circrna_005995在t细胞中表达量最高。故后续细胞实验选择在jurkat t细胞上展开。

19、rna免疫共沉淀（rip）实验结果显示，与阴性对照igg相比，m6a去甲基化酶alkbh5与hsa_circrna_005995结合显著增多（input>3%），证明hsa_circrna_005995与alkbh5有结合。

20、分别用hsa_circrna_005995过表达和alkbh5敲低慢病毒感染jurkat细胞，qrt-pcr实验表明，敲低alkbh5之后，hsa_circrna_005995的表达水平明显升高。放线菌素d处理后，与vector组相比，过表达alkbh5组hsa_circrna_005995的稳定性明显降低（p<0.05），敲低alkbh5之后，与对照组相比， alkbh5敲低组hsa_circrna_005995的稳定性显著升高（p<0.05）。

21、hsa_circrna_005995过表达细胞模型增殖曲线结果显示：与对照组相比，hsa_circrna_005995组的细胞活力显著增强。

22、用携带或不携带hsa_circrna_005995的病毒载体分别感染jurkat细胞，随后分别提取两组rna，对th细胞特异性转录因子t-bet（th1）、gata3（th2）、rorc（th17）、foxp3（treg）分别进行rt-qpcr检测，结果显示：与vecter组相比，hsa_circrna_005995组的th2和treg转录因子表达量上升，th1和th17转录因子表达量无明显改变。后续elisa检测也发现，与对照组相比，过表达hsa_circrna_005995组的白介素10（il-10）的表达水平显著上调。

23、总之，过表达hsa_circrna_005995可以促进jurkat细胞增殖，使得th2和treg在mrna水平上升，th1和th17在mrna水平无明显变化。hsa_circrna_005995在t1d患者显著上调，过表达hsa_circrna_005995使得th细胞亚群比例发生改变，提示hsa_circrna_005995作为t1d治疗靶点的潜能。

24、本发明首次发现t1d患者pbmc中具有m6a修饰的hsa_circrna_005995水平显著升高，可以影响t细胞的增殖，改变t细胞亚群比例，并且hsa_circrna_005995可以与去甲基化酶alkbh5相互作用，alkbh5-hsa_circrna_005995调节轴可能作为t1d潜在的治疗靶点。

25、除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。