骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体及其构建方法

本发明属于生物，具体涉及骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体及其构建方法。

背景技术：

1、核酸适配体是检测骨性关节炎早期生物标志物的理想工具。由于血清生物标记物检测敏感性及特异性高，临床上容易实施，因此逐渐成为被广泛用于疾病诊断的手段。研究表明，软骨酸性蛋白1(crtac1)是一种新的潜在的骨性关节炎生物标志物，可以用于骨性关节炎的疾病监测，但目前缺乏针对老年骨性关节炎的早期预警血清标记物研究。近年来，核酸适配体(aptamer)作为一种通过指数富集的配体系统进化(selex)技术筛选出来的一段单链寡核苷酸(rna/ssdna)，其能够通过其三维结构借助氢键、疏水键、范德华力或离子键等作用，与目标蛋白高特异性、高稳定性、高亲和力的结合。

2、已有研究证实，核酸适配体能够成功靶标离子、小分子、多肽、蛋白质、细胞和组织等。其既能够作为检测试剂及成像工具实现对特定目标的量化和追踪，还能够用于靶向载药，甚至直接作为新型的生物药物对疾病进行治疗。鉴于核酸适配体“化学抗体”的称号，其常作为特异性识别元件应用于传感器的设计，包括荧光传感器、生物传感器和电化学传感器，从而快速检测复杂样品基质中的目标物质。由于核酸适配体是由化学合成而来，可随意在其3’或5’末端进行一些化学修饰；而且，在核酸适配体任何一端引入化学基团均不会干扰适配体与其靶标物的结合。例如，标记有氨基或巯基的适配体可以分别与羧基或马来酰亚胺染料进行化学偶联；生物素标记的适配体可以与染料标记的链霉亲和素结合，从而连接多个染料分子，导致荧光信号显著增强。

3、因此，本发明针对预警老年骨性关节炎发生和进展的血清标记物软骨酸性蛋白1构建核酸适配体，为oa的早期诊断提供有效手段，实现早期干预，进而抑制oa的发生发展。

技术实现思路

1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体及其构建方法，为oa的早期诊断提供有效手段，实现早期干预，进而抑制oa的发生发展。

2、技术方案：第一方面，本发明提供骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体，所述适配体至少包括seq id no.2-14中的一条序列，具体如下所示：

3、seq id no.2：

4、5′-ataccagcttattcaattcagccgaagcacgacggggtccgcgagt tcaggtcttttcagctaagccaagatagtaagtgcaatct-3′；

5、seq id no.3：

6、5′-ataccagcttattcaattgtcacggcactcgggattgttccaccggt gatgtcccccggtatctccttagatagtaagtgcaatct-3′；

7、seq id no.4：

8、5′-ataccagcttattcaattcaccctactccaagaccctaagtagttca gctttcaggtaagcctctcatagatagtaagtgcaatct-3′；

9、seq id no.5：

10、5′-ataccagcttattcaattcgagacaacacacgggacacactcttact catcccctattcctcacggctagatagtaagtgcaatct-3′；

11、seq id no.6：

12、5′-ataccagcttattcaattgccggagaataatgcactgggttttattgt cgtgctaagaatacagtccaagatagtaagtgcaatct-3′；

13、seq id no.7：

14、5′-ataccagcttattcaattcagccgaagcacgacggggtccgcgagt tcaggtcttttcagctaagccgagatagtaagtgcaatct-3′；

15、seq id no.8：

16、5′-ataccagcttattcaattccctcgcgtcctgatggcgtccatcgaatt gaactaaacgtttaagcgctagatagtaagtgcaatct-3′；

17、seq id no.9：

18、5′-ataccagcttattcaattcagccgaagcacgacggggtctgcgagt tcaggtcttttcagctaagccaagatagtaagtgcaatct-3′；

19、seq id no.10：

20、5′-ataccagcttattcaattcagccgaagcacgacagggtccgcgagt tcaggtcttttcagctaagccaagatagtaagtgcaatct-3′；

21、seq id no.11：

22、5′-ataccagcttattcaattgccggagaataatgcactgggttttattgt cgtgctaagaatacagtccgagatagtaagtgcaatct-3′；

23、seq id no.12：

24、5′-ataccagcttattcaattcgaggccccctgctccgccgttacgcgaa taattccccccactcatgcgtagatagtaagtgcaatct-3′；

25、seq id no.13：

26、5′-ataccagcttattcaattgccggagaataatgcactgggttttattgt cgtgctaaggatacagtccaagatagtaagtgcaatct-3′；

27、seq id no.14：

28、5′-ataccagcttattcaattcccgacgacgacttttacgaatgcgtgag acctacgcgctcaccgcaacgagatagtaagtgcaatct-3′。

29、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体的构建方法，包括以下步骤：

30、s1、构建人来源的crtac1蛋白的质粒，通过转化感受态细胞过表达、分离纯化得到人来源的带有组氨酸标记的crtac1蛋白，备用；

31、s2、合成随机核酸适配体文库，其序列如seq id no.1所示：

32、5’-ataccagcttattcaatt-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn-agatagtaagtgcaatct-3’，其中n为a、t、c、g中任意碱基；

33、s3、筛选：以步骤s1构建的带有组氨酸标记的crtac1蛋白结合在镍磁珠上作为正筛选体系，只结合组氨酸的镍磁珠作为负筛体系，采用selex技术，对步骤s2合成的随机核酸适配体文库进行重复筛选，富集能够特异性结合crtac1蛋白的核酸适配体；

34、s4、分析：对测序结果进行生物信息学分析，包括二级结构预测和分子对接预测，进一步优化适配体结构，筛选出保守性好，亲和力强的核酸适配体序列文库，其序列如seqid no.2-14所示。

35、第三方面，本发明提供一种血清检测试剂盒，包括第一方面所述的骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体。

36、第四方面，本发明提供第一方面所述的骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体或第三方面所述的血清检测试剂盒在监测骨关节炎发展进程中的应用。

37、优选的，所述骨关节炎为老年骨关节炎。

38、有益效果：本发明骨关节炎早期生物标志物软骨酸性蛋白靶向适配体及其构建方法，针对预警老年骨性关节炎发生和进展的血清标记物通过配体指数级富集系统进化技术(selex)筛选与crtac1特异性结合的核酸适配体，通过高通量测序确定序列，并进一步进行生物信息学分析，从而筛选出与目标蛋白有亲和潜力的序列，进而为开发基于核酸适配体的血清检测试剂盒奠定基础。