一种猴痘病毒胸苷激酶晶体结构及其制备方法和应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种猴痘病毒胸苷激酶晶体结构及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猴痘病毒(mpoxvirus,mpxv)是一种有包膜的双链脱氧核糖核苷酸(dna)病毒，属于痘病毒科，正痘病毒属。由于缺少针对猴痘病毒的有效治疗药物以及预防方案，猴痘病毒至今仍未被完全消灭。为了应对和预防类似的疫情再次爆发，开发新的药物和治疗手段至关重要。

2、在当前的猴痘病毒疫情中，没有特定的安全有效的的治疗方法，因此研究人员应该致力于探索新的预防策略和治疗方法(新的抗病毒药物)，以防范猴痘的再次暴发或其他痘病毒带来的威胁。在抗病毒药物的靶点筛选中，研究人员往往会聚焦于病毒的复制过程，希望可以找到对病毒的基因复制和组装起关键作用的蛋白，通过实验确定这些蛋白发挥作用的具体机制，进而针对这个蛋白开发特异性抗病毒药物。而随着结构生物学方法的逐渐成熟，研究人员可以解析靶点蛋白的结构，再根据结构信息设计特异性小分子药物，通过活性实验来进一步筛选小分子抑制剂，最终通过细胞实验、动物实验以及临床实验完成抗病毒药物的研发。

3、猴痘病毒主要在细胞胞浆中的病毒工厂中进行基因组复制和子代病毒组装。为了高效复制基因组，一方面，猴痘病毒会上调宿主细胞内核苷酸的合成；另一方面，猴痘病毒自身还编码了胸苷激酶(thymidinekinase,tk)，可以通过补救合成途径促进核苷酸合成。tk可将腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,atp)的γ-磷酸基团转移到脱氧胸苷(deoxythymidine,dt)以产生脱氧胸苷单磷酸(deoxythymidinemonophosphate,dtmp)，这一步通常是核苷酸补救合成途径中的限速步骤。随后，合成产物dtmp会被进一步磷酸化，形成脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate,dttp)从而参与dna的复制和合成。已有研究发现，胸苷激酶的缺乏会导致猴痘病毒毒力减弱、免疫原性下降，还会导致胞内病毒载量的明显下降，这些都表明胸苷激酶在猴痘病毒生命周期中发挥十分关键的作用，可能成为潜在的药物靶点。

4、然而目前针对猴痘病毒胸苷激酶(monkeypoxvirusthymidinekinase，mpxvtk)研究仍处于初级阶段，其详细的结构信息尚未被解析，催化模式尚不清楚，而直接靶向tk的药物研发领域仍是空白。我们希望通过结构生物学的方法解析猴痘病毒胸苷激酶的三维结构，分析其作用模式以及明确在其催化过程中发挥作用的氨基酸残基，并建立测定其催化活性的实验体系，为针对胸苷激酶的药物研发提供数据参考，这对靶向mpxvtk的抗病毒化合物开发具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明通过结构生物学的方法获得猴痘病毒胸苷激酶的蛋白晶体，解析了猴痘病毒胸苷激酶的三维结构，并进行了进一步的研究。基于此，本发明提供了如下技术方案：

2、本发明的第一方面提供一种猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体，所述猴痘病毒胸苷激酶为野生型，其结构参数为：

3、晶体结构空间群：c 121；

4、晶胞参数：分辨率范围：数据完整性：99％；

5、所述猴痘病毒胸苷激酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明的第二方面提供一种猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体，所述猴痘病毒胸苷激酶为突变型mpxv tk-e83a，其结构参数为：

7、晶体结构空间群：c 121；

8、晶胞参数：分辨率范围：数据完整性：98％；

9、所述突变型猴痘病毒胸苷激酶mpxv tk-e83a的氨基酸序列如seq id no.2所示。

10、上述的两种猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体，所述猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体结构由4个不对称单体组成，分别为：单体a(1)、单体b(2)、单体c(3)、单体d(4)，同时单体b(2)中还含有一个脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate,dttp)配体；每个单体由n端的5个α螺旋与6个β折叠、c端的一个锌指结构以及夹在n端螺旋/折叠区域和c端锌指结构中间的一个p-loop以及两个套索组成；α螺旋1，即含lys17-ala31氨基酸区段；α螺旋2，即含leu66-asp68氨基酸区段；α螺旋3，即含gly84-phe86氨基酸区段；α螺旋4，即含ile90-glu100氨基酸区段；α螺旋5，即含leu122-leu127氨基酸区段；β折叠1，即含met130-leu134氨基酸区段；β折叠2，即含his5-ile10氨基酸区段；β折叠3，即含lys102-ala107氨基酸区段；β折叠4，即含val78-ile81氨基酸区段；β折叠5，即含cys35-tyr40氨基酸区段；β折叠6，即含leu61-val63氨基酸区段；锌指结构，即含ala136-asp176氨基酸区段；p-loop，即含gly11-ser18氨基酸区段；套索1，即含arg150-tyr166氨基酸区段；套索2，即含ala106-leu122氨基酸区段。

11、上述的两种猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体，所述晶体三维结构的第82位天冬氨酸、83位谷氨酸构成催化活性中心。

12、本发明的第三方面提供上述野生型的猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体的制备方法，包括如下步骤：将制备好的高纯度猴痘病毒胸苷激酶蛋白浓缩至浓度为10-20mg/ml，使用结晶试剂盒作为晶体生长的初筛条件，采用座滴法进行结晶，晶体培养温度为16-22℃，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂的体积为1:1-2，结晶试剂的组成为：0.18-0.22m乙酸铵，0.08-0.12m hepes，15-25％w/v聚乙二醇3350，ph 6.5-7.5。

13、所述高纯度猴痘病毒胸苷激酶蛋白的制备方法包括如下步骤：构建融合了野生型的猴痘病毒胸苷激酶全长基因的重组载体，该载体转化至大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白mpxv tk，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出目的蛋白，再通过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的野生型的猴痘病毒胸苷激酶的蛋白。

14、本发明的第四方面提供上述的突变型的猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体的制备方法，包括如下步骤：将制备好的高纯度mpxv tk-e83a蛋白浓缩至浓度为10-20mg/ml，使用结晶试剂盒作为晶体生长的初筛条件，采用座滴法进行结晶，晶体培养温度为16-22℃，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂的体积为1:1-2，结晶试剂选自以下任意一种组成：

15、(1)0.08-0.12m hepes，20-30％peg 3350，ph 7.0-7.6；

16、(2)0.18-0.22m硫酸铵，0.08-0.12m bis-tris，20-30％peg 3350，ph 6.9-7.1；

17、(3)0.18-0.22m硫酸锂，0.08-0.12m bis-tris，20-30％peg 3350，ph 6.9-7.1；

18、(4)0.08-0.12m bis-tris propane，7-9％peg 20000，ph 8.9-9.1。

19、所述高纯度mpxvtk-e83a蛋白的制备方法包括如下步骤：构建融合了突变的猴痘病毒胸苷激酶全长基因的重组载体，该载体转化至大肠杆菌，从而表达带有标签的融合蛋白mpxvtk，将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出目的蛋白，再通过凝胶过滤层析的方法得到高纯度的野生型的猴痘病毒胸苷激酶的蛋白；

20、突变的猴痘病毒胸苷激酶全长基因的扩增引物为：

21、e83a正向：5’-ggaatagatgcgggtcagtttttcccggatattgttgaattt-3’；

22、e83a反向：5’-aaactgacccgcatctattccaatcacgctaaaatccgtgat-3’。

23、本发明的第五方面提供上述两种猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体中的任一种在抗猴痘病毒药物筛选或者在制备猴痘病毒疫苗中的应用。

24、本发明的第六方面提供上述的猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体在筛选小分子抑制剂中的应用：将上述的猴痘病毒胸苷激酶蛋白晶体的三维结构信息用于计算机软件筛选小分子抑制剂。

25、本发明的有益效果是：

26、通过在大肠杆菌中高效表达并纯化了猴痘病毒胸苷激酶，并通过生化实验证实其具有催化活性。解析了具有活性的猴痘病毒胸苷激酶的晶体结构，发现天然状态下它以四聚体形式存在。此外，还鉴定了参与催化反应的氨基酸残基，并研究了其对酶活性的影响。最后，研究了反馈抑制剂dttp对胸苷激酶活性的抑制效果。

27、总的来说，本发明首次提供了猴痘病毒胸苷激酶的晶体结构，深入揭示了mpxvtk及其突变体的结构特征，还对其催化机制进行了分析，为靶向胸苷激酶的抑制剂开发提供了重要依据，同时也为猴痘病毒的治疗与预防策略的发展提供了重要的参考和理论基础。