一种结合FOXJ1蛋白的核酸适配体及其应用

(一)本发明属于生物，具体涉及一种结合foxj1蛋白的核酸适配体及其应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、fox转录因子家族是近年来发现的一类新的参与肿瘤发生发展的重要分子。fox家族成员在胃癌中发挥的作用也吸引了众多研究者。已有研究发现，一方面，foxc2、foxm1和foxq1在胃癌中表达增高，foxm1b可以促进血管内皮生长因子的活化和诱导胃癌血管的生成，提示其在胃癌中可能发挥促癌作用。另一方面，foxd3在幽门螺杆菌感染诱导的超甲基化过程中下调，参与hp感染引发的胃癌；其次foxo3a与runx3协同活化bim，共同诱导胃癌细胞凋亡，提示foxd3和foxo3a可能参与抑制胃癌的发生。除此之外，目前有发现，foxm1和foxc1可通过促进mmp-7、rhoc和rock1的表达或诱导emt促进肝癌转移；foxq1可通过诱导emt和募集巨噬细胞浸润发挥促癌作用并促进转移发生。

2、foxj1是叉头/翼螺旋(fox)转录因子家族的成员，具有通过拮抗t细胞中的nf-κb活化，抑制自发性自身免疫力的能力，它作为fox家族的成员之一，除了在胚胎发育和分化、纤毛形成、抑制自身免疫反应等生物学行为中起着重要的调控作用之外，近年来也发现foxj1在不同肿瘤的发生发展中发挥着不同的作用：一方面，foxj1在乳腺癌和卵巢癌中可能发挥抑癌作用；另一方面，也有研究报道foxj1在肝癌中可能发挥促癌作用。提示我们，foxj1在肿瘤中可能呈异质性表达，并在不同的肿瘤微环境中发挥不同作用。

3、核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配体系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。因此如果能找到与foxj1蛋白具有更高的亲和力，并且具有高特异性的核酸适配体，将有助于实现foxj1蛋白的高灵敏度和高特异性检测，有助于靶向foxj1蛋白的药物开发。

4、因此，急需找到一种针对foxj1蛋白的结合亲和力高，特异性好，易于修饰和人工合成，稳定性好，使用便利的核酸适配体。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种结合foxj1蛋白的核酸适配体及应用，通过改进筛选条件，筛选获得一种分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的核酸适配体，而且能保持与foxj1蛋白的高亲和力和高特异性结合，可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，应用前景广阔。

2、本发明采用的技术方案是：

3、第一方面，本发明提供一种结合foxj1蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体具有如seq id no.1、seq id no.2所示的核苷酸序列；或具有与seq id no.1、seq id no.2至少30％同源性且结合foxj1蛋白的核苷酸序列；或具有由如seq id no.1、seq id no.2所示的核苷酸序列转录的rna序列。

4、基于selex技术，本发明设计并合成了一个随机单链dna文库和相应的引物，用来筛选具有分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力结合foxj1蛋白的核酸适配体，由此筛选得到两条高亲和力结合foxj1蛋白的核酸适配体，分别为wjm-01(seqid no.1)、wjm-11(seq id no.2)，该核酸适配体与foxj1蛋白具有较高的亲和力，并且具有较高的特异性。所述foxj1蛋白氨基酸序列如seq id no.3所示。

5、可以理解的是，与本发明提供的核酸适配体具有至少30％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％的同源性且结合foxj1蛋白的核苷酸序列，例如可将上述核酸适配体的任一个所示的核苷酸序列删除部分序列或增加部分序列，依然具有与foxj1蛋白的高亲和力，依然在本发明的保护范围内。本发明所述核酸适配体还包括对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合foxj1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。因此，所述核酸适配体的核苷酸序列被修饰且修饰后的核酸适配体特异性结合foxj1蛋白，所述修饰选自磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧和同位素化中的至少一种，依然在本发明的保护范围内。

6、第二方面，本发明提供一种核酸适配体的缀合物或衍生物，所述核酸适配体具有如seq id no.1、seq id no.2所示的核苷酸序列；所述核酸适配体的缀合物包括荧光标记物；所述核酸适配体的衍生物包括由核酸适配体或核酸适配体的缀合物的核苷酸序列骨架改造成的结合foxj1蛋白的硫代磷酸酯骨架或肽核酸。

7、本发明所述的核酸适配体的缀合物，是指在核酸适配体上连接其他基团，比如可以连接具有标志作用的荧光标记物，例如fam、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶标记等，使修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合foxj1蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。

8、换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与foxj1蛋白的结合。

9、此外，本发明还提供核酸适配体衍生物，所述衍生物是由上述核酸适配体的核苷酸序列的骨架改造成结合foxj1蛋白的硫代磷酸酯骨架而得，或者是前述任一项技术方案中所述核酸适配体或核酸适配体的缀合物改造成的结合foxj1蛋白的肽核酸。条件是所述衍生物都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，且都与foxj1蛋白结合。

10、本发明所使用的术语“硫代磷酸酯骨架”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指rna和dna核酸适配体的磷酸二酯骨架的非桥键氧原子可以被一个或两个硫原子取代，分别产生具有硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键的硫代磷酸酯骨架。已知这样的硫代磷酸酯骨架具有增加的对其靶标的结合亲和力，以及对核酸酶降解的增强的抗性。

11、本发明所使用的术语“肽核酸”具有本领域普通技术人员一般理解的含义，其是指一种人工合成dna分子类似物，于1991年由nielsen等首次报道。用n-2-(氨乙基)-甘氨酸(n-(2-aminoethyl)-glycine)单位代替糖-磷酸酯骨架作为重复结构单元，合成了以肽键连接的寡核苷酸模拟物，称为肽核酸。由于肽核酸(pna)没有如dna或rna上的磷酸基团，因此pna与dna之间缺乏电性相斥的现象，使两者之间的结合强度大于dna与dna之间的结合强度。

12、

13、第三方面，本发明提供了一种包含所述核酸适配体的用于纯化或检测foxj1蛋白的产品，所述产品中包括所述的核酸适配体或所述的核酸适配体的缀合物或衍生物；所述产品包括试剂盒、检测芯片、层析检测装置的任意一种或多种。

14、第四方面，本发明提供了一种结合foxj1蛋白的核酸适配体的筛选方法，所述方法是在selex筛选方法(10.1016/j.biochi.2018.09.001)的基础上，在磁珠法筛选的步骤中，从第4-7轮筛选过程中添加血清进行竞争，进一步提高核酸适配体的特异性与稳定性。

15、进一步，在第4～7轮添加血清，具体过程为：第4、5轮反筛上清中添加体积浓度2％血清，第6、7轮反筛上清中添加体积浓度5％血清，用于正筛，所述血清为人血清为正常人血清，购买自北京索莱宝科技有限公司，货号：sl010。

16、进一步，所述方法包括以下步骤：

17、(1)合成随机单链dna文库，随机区长度为20-40bp；

18、(2)磁珠法筛选：进行至少7轮的反筛与正筛，每一轮正筛之前都先进行反筛，且第4、5轮反筛上清中添加体积浓度2％血清，第6、7轮反筛上清中添加体积浓度5％血清，用于正筛；所述反筛是利用偶联了his小肽的磁珠与随机单链dna文库25℃孵育1h，目的是将与his以及与磁珠结合的一些序列去除掉；所述筛选是将反筛上清加入到偶联了foxj1蛋白的磁珠中25℃孵育1h。

19、进一步，步骤(1)随机单链dna文库序列为：

20、5’-attggcactccacgcatagg-36n-cctatgcgtgctaccgtgaa-3’，n代表碱基c、t、a、g。

21、核酸适配体筛选常规条件是在离子缓冲液中进行，而本发明在筛选条件下逐步添加一定浓度的血清，一方面因为血清中含有丰富的蛋白，可以与磁珠表面的蛋白竞争性的与文库结合，从而去除那些与靶标foxj1蛋白结合能力很弱或者只是吸附上的序列。另一方面，适配体在血清环境中结合靶标，可以更好的满足后期基于核酸适配体开发的应用的实际检测环境。研究证明，在筛选的后续轮次筛选中，采用高浓度的血清，能够筛选获得亲和力更高，特异性更好的核酸适配体。

22、第五方面，本发明提供了所述核酸适配体在制备检测或纯化foxj1蛋白试剂中的应用，所述核酸适配体包括核酸适配体的缀合物或衍生物。所述检测foxj1蛋白试剂包括foxj1蛋白成像试剂。

23、第六方面，本发明提供了所述的核酸适配体在制备靶向foxj1蛋白制剂中的应用，所述核酸适配体包括核酸适配体的缀合物或衍生物。所述靶向foxj1蛋白制剂包括用于诊断和治疗foxj1表达异常的试剂或药物。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

25、1、通过改进筛选条件，筛选获得一种化学性质稳定、易于保存和标记的能够以高亲和力和高特异性结合foxj1蛋白的核酸适配体；

26、2、本发明提供的核酸适配体结构相对稳定、简单、易于修饰以及短期内可以人工合成、化学性质稳定、易于保存和标记；

27、3、本发明提供的核酸适配体可用于检测、诊断、成像以及治疗等方面，如可用于纯化或高灵敏度检测foxj1蛋白；可用于制备靶向foxj1蛋白的药物；可用于制备诊断和治疗foxj1表达异常的试剂或药物等等，应用前景广阔。