一株源于酸面团的植物乳植杆菌及其应用

本发明涉及一株源于酸面团的植物乳植杆菌及其应用，属于发酵工程与生物。

背景技术：

1、酸面团是由小麦面粉等谷物粉质与水混合经酵母菌、乳酸菌等微生物经自然发酵得到的一种传统发酵剂。酸面团体系复杂，由丰富的微生物菌群结构组成，在发酵过程中，乳酸菌是最主要的发酵微生物之一。酸面团中乳酸菌主要由大量的乳杆菌属以及少量的魏斯氏菌属、片球菌属、链球菌属、明串珠菌属和肠球菌属等构成。乳酸菌作为益生菌，广泛存在于自然环境和人体肠道内，是被公认为的安全食品级微生物，具有降低胆固醇、抗氧化、抑制有害菌生长等多种益生作用。此外，乳酸菌还能分解可发酵糖，产生乳酸等有机酸，在赋予食品以酸味的同时，还能与脂肪酸和酒精作用产生酯类，赋予食品独特的香味。现有报道来源于酸面团中的乳酸菌超过60种，其中最具代表性的主要以异型发酵乳酸杆菌属为主。植物乳植杆菌是乳酸菌的一种，与其它乳酸菌相比有较强的优势，为人和动物肠道内的正常益生菌群，亦是安全的食品级微生物，植物乳植杆菌在食品工业中的重要地位，越来越受到人们的关注与重视。

2、微生物胞外多糖(exopolysaccharide，eps)是微生物在生长过程中分泌到胞外基质中的一类粘液类化合物。和植物多糖相比，微生物多糖具有生产周期短、不受地域、季节条件限制等优势，具有广阔的发展前景。目前对植物乳植杆菌胞外多糖的研究较多，专利cn102453689b公开了一株产胞外多糖的植物乳植杆菌及其应用，其胞外多糖具有提高免疫的作用；专利cn110106121b公开了植物乳植杆菌jnulcc001的胞外多糖中主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成，并可用于乳清发酵；专利cn111100810b公开了植物乳植杆菌dnb1及其胞外多糖具有显著的抗氧化能力，0.4mg/ml的胞外多糖对dpph自由基的清除率达到57.66％，对羟基自由基和abts自由基清的清除能力达到，分别达到32.65％、28.64％。上述现有技术多集中于对植物乳植杆菌胞外多糖本身性质的研究，忽视了胞外多糖的作为添加剂的功能性。

3、乳酸菌胞外多糖通常被用作商业稳定剂的天然替代品，从而起到增加发酵液的黏度，增强稳定性，提高乳化性和凝胶特性等理化特性，达到改善发酵液的流变性质，质感和口感的目的。因此可以预见，植物乳植杆菌胞外多糖作为一种新型、高效、安全的生理功能调节剂，必将具有理论研究意义和实际应用价值。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明从酸面团中筛选出一株植物乳植杆菌l23104，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.29668，该菌株可高产胞外多糖，且具有优良的发酵性能，其胞外多糖具有抑制自由基活性的作用，可达到增强发酵食品品质、提高发酵食品安全性的作用，具有广阔的应用前景。

2、本发明的第一个目的是提供一种植物乳植杆菌(lactiplantibacillusplantarum)l23104，所述植物乳植杆菌已于2024年1月18日保藏于中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.29668。

3、本发明的植物乳植杆菌l23104具有如下功能：

4、(1)本发明提供了一株植物乳植杆菌l23104，在20℃～40℃内菌液od值最高，表明其在该温度范围内生长状况较好，适合发酵产品对于温度的不同需求。

5、(2)本发明提供了一株能够高产胞外多糖的植物乳植杆菌l23104，培养24h时，胞外多糖含量达到最大为2460.12±1.46mg/l，能够作为稳定剂增强发酵产品的稳定性，达到提高产品质感和口感的目的。

6、(3)采用本发明提供的高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104所产的多糖溶液进行抗氧化实验，植物乳植杆菌l23104对ho·、dpph·和abts+的清除率均高于对照组vc，分别为(88.55±0.28)％、(82.15±0.14)％和(85.60±0.26)％，说明植物乳植杆菌l23104所产胞外多糖具有较好的抗氧化能力。

7、(4)采用本发明提供的高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104，在发酵食品如酸奶、面包、奶酪、泡菜、豆豉和辣椒酱等时，与市售发酵剂相比，植物乳植杆菌l23104发酵结束后多糖含量均明显增加，增加15％以上，最多增加25％。

8、(5)采用本发明提供的高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104，在发酵动物饲料如与青贮苜蓿饲料时，多糖含量增加21.5％，可为苜蓿青贮提供了营养物质，促进了发酵进程。

9、在一种实施方式中，所述植物乳植杆菌的菌落形态特征为菌落凸起，呈乳白色，圆形光滑，半透明，边缘整齐。

10、本发明还提供一种微生物制剂，所述微生物制剂含有上述植物乳植杆菌l23104和/或其代谢物。

11、在一种实施方式中，所述的微生物制剂是固体制剂或液体制剂应用方式。

12、在一种实施方式中，每克或每毫升微生物制剂中的植物乳植杆菌数量≥1×108cfu。

13、在一种实施方式中，所述微生物制剂含有上述植物乳植杆菌l23104的活细胞或冷冻干燥得到的干菌体或固定化的细胞，或以其他任何形式存在的含胞外多糖植物乳植杆菌l23104的菌株。

14、本发明的第二个目的是提供含有植物乳植杆菌l23104的微生物菌剂。

15、在一种实施方式中，所述微生物菌剂按如下方法制备：将活化后的植物乳植杆菌l23104接种于装有50ml液体mrs培养基的三角瓶中，在37℃培养24h，获得菌株的初级种子液；再以5.0％的体积比接种于液体mrs培养基中，在37℃培养24h后得菌浓为108cfu/ml的菌剂。

16、本发明的第三个目的是提供上述植物乳植杆菌l23104或任一上述微生物制剂制备得到的胞外多糖。

17、在一种实施方式中，所述胞外多糖按如下方法制备：

18、将植物乳植杆菌l23104活化两代接种到mmrs(mrs中添加5％w/w蔗糖)液体培养基中，于37℃培养24h。将试管置于水浴锅中沸水浴10min后冷却至室温，4℃下以高速离心30min去除沉淀，取上清液后加入三氯乙酸(tca)溶液至最终浓度为4％，4℃过夜。高速离心30min取上清液并加入95％(w/v)预冷乙醇后静置过夜，在4℃下高速离心30min，重复操作两次。将沉淀重新溶解于去离子水中，充分溶解后在4℃条件下使用截留分子量为8000～14000da的透析袋进行透析48h，透析完成后冷冻干燥，即得到胞外多糖。

19、在一种实施方式中，上述植物乳植杆菌l23104或任一上述微生物制剂制备得到的胞外多糖具有清除自由基的抗氧化能力。

20、本发明的第四个目的是提供上述植物乳植杆菌l23104或任一上述微生物制剂在制备胞外多糖或发酵制品或抗氧化产品或饲料添加剂中的应用。

21、在一种实施方式中，所述发酵制品包括乳制品、面制品、发酵蔬菜、调味品或动物饲料，其中，所述乳制品包括酸奶或奶酪；所述面制品包括面包；所述发酵蔬菜包括泡菜；所述调味品包括豆豉或辣椒酱；所述动物饲料包括苜蓿。

22、在一种实施方式中，所述的发酵食品包括但不限于酸奶、面包、奶酪、泡菜、豆豉和辣椒酱等。

23、在一种实施方式中，所述的应用是用于酸奶发酵，使用所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104为发酵剂。

24、在一种实施方式中，所述酸奶发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104以0.5％～10.0％w/w的接种量接种到牛奶中，在30℃～42℃下经发酵8h～24h后得到。

25、在一种实施方式中，所述的应用是用于面团发酵，使用所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104为发酵剂。

26、在一种实施方式中，所述面团发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104为发酵剂，分别以0.25ml～3.0ml和0.05g～0.25g的添加量添加到面团中，以高筋面粉、蔗糖、氯化钠和饮用水为主要原料，按照(10.0～25.0)：(0.5～1.5)：(1.0～3.0)：(5.0～10)的质量比例混合，经发酵和焙烤等工艺得到。

27、在一种实施方式中，所述的应用是用于奶酪发酵。

28、在一种实施方式中，所述面团发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104发酵剂，以2％～8％(v/v)的比例接种到巴氏杀菌奶中，经发酵、过滤、切割、吊滤、二次发酵、加盐、压模包装等工艺得到。

29、在一种实施方式中，所述的应用是用于泡菜发酵，使用所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104为发酵剂。

30、在一种实施方式中，所述泡菜发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104发酵剂，以1.0％～2.0％v/v的接种量接种到芥菜中，食盐添加量为1.0％～3.0％w/w，经装坛、压紧、密封和发酵等工艺得到。

31、在一种实施方式中，所述的应用是用于豆豉发酵。

32、在一种实施方式中，所述豆豉发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104发酵剂，以1.0％～3.0％v/v的接种量，将菌液均匀喷洒于接种到高温蒸煮过的大豆中，置于温度38℃和湿度70％下发酵12h～18h得到。

33、在一种实施方式中，所述的应用是用于辣椒酱发酵。

34、在一种实施方式中，所述辣椒酱发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104发酵剂，以1.0％～3.0％v/v的接种量接种于沸水烫煮过的辣椒中，加入1.0％～5.0％w/w的食盐，30℃条件下发酵2～5d后得到。

35、本发明的第六个目的是提供上述植物乳植杆菌l23104或任一上述微生物制剂在发酵动物饲料中的应用。

36、在一种实施方式中，所述的动物饲料包括但不限于青贮苜蓿饲料等。

37、在一种实施方式中，所述青贮苜蓿饲料发酵是将所述高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104发酵剂以梯度浓度接种到苜蓿中，经过真空密封后室温发酵20d～45d得到。

38、本发明的第七个目的是提供一种降低辣椒酱中辣椒碱的方法，在制备辣椒酱时，添加上述的植物乳植杆菌l23104或任一上述微生物制剂或上述胞外多糖。

39、在一种实施方式中，辣椒酱中植物乳植杆菌l23104或植物乳植杆菌l23104菌剂的添加量为0.5％～5％(接种量为105～107cfu/g)。

40、本发明的第八个目的是提供一种提高青贮苜蓿饲料中粗蛋白含量、干物质和碳水化合物的方法，在制备青贮苜蓿饲料时，添加上述的植物乳植杆菌l23104或任一上述微生物制剂或上述胞外多糖。

41、在一种实施方式中，青贮苜蓿饲料红植物乳植杆菌l23104或植物乳植杆菌l23104菌剂的添加量为105～107cfu/g湿重。

42、有益效果

43、本发明从酸面团中筛选出一株植物乳植杆菌l23104，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.29668，该菌株可高产胞外多糖，且具有优良的发酵性能，其胞外多糖具有抑制自由基活性的作用，可达到增强发酵食品品质、提高发酵食品安全性的作用，具有广阔的应用前景。

44、具体的：

45、(1)本发明提供了一株植物乳植杆菌l23104，在20℃～40℃内菌液od值最高，表明其在该温度范围内生长状况较好，适合发酵产品对于温度的不同需求。

46、(2)本发明提供了一株能够高产胞外多糖的植物乳植杆菌l23104，培养24h时，胞外多糖含量达到最大为2460.12±1.46mg/l，能够作为稳定剂增强发酵产品的稳定性，达到提高产品质感和口感的目的。

47、(3)采用本发明提供的高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104所产的多糖溶液进行抗氧化实验，植物乳植杆菌l23104对ho·、dpph·和abts+的清除率均高于对照组，分别达到(88.55±0.28)％、(82.15±0.14)％和(85.60±0.26)％，说明植物乳植杆菌l23104所产胞外多糖具有较好的抗氧化能力。

48、(4)采用本发明提供的高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104，在发酵食品如酸奶、面包、奶酪、泡菜、豆豉和辣椒酱等时，与市售发酵剂相比，植物乳植杆菌l23104发酵结束后多糖含量均明显增加，增加15％以上，最多增加25％。

49、(5)采用本发明提供的高产胞外多糖植物乳植杆菌l23104，在发酵动物饲料如与青贮苜蓿饲料时，多糖含量增加21.5％，可为苜蓿青贮提供了营养物质，促进了发酵进程。

50、生物保藏材料

51、本发明的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)l23104，分类命名为植物乳植杆菌lactiplantibacillus plantarum，已于2024年1月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.29668，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。