一种检测亚硝酸盐的荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于亚硝酸盐检测，具体的说涉及一种快速检测亚硝酸盐的荧光探针，还涉及该探针的制备方法和应用。

背景技术：

1、亚硝酸盐（no2-）是一种易溶于水的无机盐，作为抗氧化剂、抑菌剂和着色剂等，广泛应用于食品工业中。摄入过量的亚硝酸盐会对人体健康造成威胁，增加患癌的风险。2008年，世界卫生组织规定，亚硝酸盐的最大限量为65μm，食品中亚硝酸盐的检测是食品安全的一项重要内容，构建便捷、快速、准确、可靠的亚硝酸盐检测方法对于亚硝酸盐的市场监控具有重要意义。

2、荧光探针法具有便捷、灵敏、快速等特点，是亚硝酸快速检测的理想方法。基于亚硝酸盐的重氮化反应机制，研究者们构建了各种亚硝酸盐荧光探针，然而，目前所报道的探针在实际检测应用中存在在抗干扰能力差、反应速度慢、灵敏度达不到检测试剂需要，以及探针水溶性需要加入有机溶剂辅助反应等局限性。

技术实现思路

1、本发明提供一种检测亚硝酸盐荧光探针及其制备方法和应用，基于罗丹明的螺开环反应，在酸性条件下，探针分子与no+反应使螺环打开，共轭体系恢复，荧光发射信号增强，实现荧光开启的检测模式，同时在探针设计中引入硼酸基团，活化苯环，提高亲电取代反应活性，同时消除胺性基团与金属离子的配位性，提高探针抗金属离子配位的抗干扰能力，实现了复杂食品基质中亚硝酸盐的快速、高选择、高灵敏检测。

2、本发明的目的是以下述方式实现的：

3、一种检测亚硝酸盐荧光探针，该荧光探针为具有螺内酰肼结构的罗丹明b衍生物，其结构式为：

4、。

5、一种上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，以荧光素为前体，经过化学反应，制备得到具有螺内酰肼结构的荧光探针，具体制备步骤如下：

6、步骤1：化合物ⅰ的制备

7、将荧光素固体粉末无水二氯甲烷，冰水浴冷却至0℃后，依次加入无水吡啶和三氟甲磺酸酐溶液，20-30℃搅拌3-5h后加水稀释并萃取，将得到的有机相用饱和食盐水洗涤，干燥减压浓缩后，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，得到化合物ⅰ。

8、步骤2：化合物ⅱ的制备

9、将化合物ⅰ样品加入三（二亚苄基丙酮）二钯、x-phos、碳酸铯和硫代吗啉-1,1-二氧化物，最后用1,4-二氧六环溶液溶解，氮气保护下在100-110℃下加热回流8-18h，反应完全后加水和二氯甲烷萃取，并用饱和食盐水洗涤后干燥减压浓缩，加入甲醇95-105ml打浆1.2-2.0h，抽滤，得到化合物ⅱ。

10、步骤3：化合物ⅲ的制备

11、将化合物ⅱ样品缓慢加入少量溶液水合肼溶液和甲醇溶液，反应体系于63-70℃下加热回流7-9h后，冷却至20-30℃，抽滤，得到化合物ⅲ；

12、步骤4：荧光探针的制备

13、将化合物ⅲ样品和2-甲酰基苯硼酸混合，加二氯甲烷和无水乙醇作为溶剂，于78-85℃下加热回流0.5-1.5h，反应液冷却至20-30℃后，旋转蒸发除去其中的二氯甲烷，抽滤，将粉红色固体用无水乙醇洗涤，干燥后即得到检测亚硝酸盐荧光探针。

14、上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，所述步骤1中， 依次加入无水吡啶和三氟甲磺酸酐溶液，25℃下搅拌4h后加水稀释并萃取2~3次。

15、上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，所述步骤2中，氮气保护下101℃加热回流12h，反应完全后加水和二氯甲烷萃取，并在用饱和食盐水洗涤后干燥减压浓缩，加入甲醇100 ml打浆1.5h。

16、上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，所述步骤3中，反应体系于65℃下加热回流8h后，冷却至25℃，抽滤。

17、上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，所述步骤4中，于80℃下加热回流1h，反应液冷却至室温后，旋转蒸发除去其中的二氯甲烷，抽滤，将粉红色固体用无水乙醇洗涤2~3次，反应液冷却至25℃后，旋转蒸发除去其中的二氯甲烷。

18、上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，所述步骤1中， 荧光素的质量为8-15g，无水二氯甲烷的体积为180-220ml，无水吡啶溶液的体积为18-23ml，三氟甲磺酸酐溶液的体积为18-23ml；所述步骤2中，1,4-二氧六环的体积为90-120 ml；所述步骤3中，化合物ⅱ的质量为4.5-5.5g，水合肼溶液的体积为0.8-1.2 ml，甲醇溶液的体积为45-55ml；所述步骤4中，化合物ⅱ的质量为0.5-1.5g， 2-甲酰基苯硼酸1.3-3.9g；二氯甲烷的体积为8-12ml，无水乙醇的体积为18-22 ml。

19、上述检测亚硝酸盐荧光探针的制备方法，所述步骤1中，荧光素的质量为10g，无水二氯甲烷的体积为200ml，无水吡啶溶液的体积为20ml, 三氟甲磺酸酐溶液的体积为20ml；所述步骤2中化合物ⅰ5.0g与三（二亚苄基丙酮）二钯0.8g、x-phos1.2g、碳酸铯7.6g和硫代吗啉-1,1-二氧化物2.7g，1,4-二氧六环的体积为100 ml；所述步骤3中化合物ⅱ的质量为3.0g，水合肼溶液的体积为0.9ml，甲醇溶液的体积为50ml；所述步骤4中，化合物ⅱ的质量为1.0g， 2-甲酰基苯硼酸2.6g，二氯甲烷的体积为10ml，无水乙醇的体积为20ml。

20、上述检测亚硝酸盐荧光探针的应用，制作成标准的探针溶液：将荧光探针用dmso溶解后，用2ml ph=1.0的hcl溶液稀释成浓度为6μm的探针溶液，然后加入待测样品，检测荧光强度，根据荧光强度与加入待测样品浓度的线性关系分别定量计算出样品中亚硝酸盐的含量。

21、上述检测亚硝酸盐荧光探针的应用，制作成标准的检测亚硝酸盐的比色卡：将荧光探针用dmso溶解后，用ph=1.5的hcl溶液稀释成浓度为16μm的探针溶液，将滤纸剪成大小相同的滤纸条，浸泡在浓度为16μm的探针溶液中，取出干燥后滴加不同浓度的亚硝酸盐溶液，观察荧光强度的变化，制作成标准的比色卡。

22、相对于现有技术，本发明有以下技术效果：

23、（1）水溶性好

24、本发明的亚硝酸盐荧光探针水溶性好，能够在纯水体系中对亚硝酸盐进行检测和含量测定，适用于水环境样品（如地下水、河流或湖泊等）中亚硝酸盐的检测。

25、（2）灵敏度高

26、本发明的亚硝酸盐荧光探针与亚硝酸盐反应非常灵敏，适用于浓度为0~4.5 μm的水环境和食品中亚硝酸盐的检测。

27、（3）特异性高，抗干扰能力强

28、本发明的亚硝酸盐荧光探针可选择性的与亚硝酸盐发生特异性反应，相较于食品和水环境中常见的其他物质而言，包括但不限于铝离子（al3+)、镁离子(mg2+)、钙离子(ca2+)、锌离子(zn2+)、钾离子(k+)、铁离子(fe2+和fe3+)、氟离子(f-)、溴离子(br-)、碘离子(i-)、乙酸根离子(ch3coo-)、磷酸根离子(hpo42-)、硫酸根离子(so42-)、碳酸根离子(co32-)、硝酸根离子(no3-)、柠檬酸根(c5h7o5coo-)、抗坏血酸（aa）、半胱氨酸（l-cys）和谷胱甘肽(gsh)等，本发明的荧光探针显示出了高特异性，并且抗干扰能力强。

29、（4）双模检测

30、本发明的亚硝酸盐荧光探针还可通过紫外-可见光谱进行检测，其检测线性范围为0.06~4.0 μm。

31、（5）稳定性好

32、本发明的亚硝酸盐荧光探针在ph=1.0的hcl缓冲溶液中荧光强度能持续保持28min以上而保持基本不变，具有优异的光稳定性和抗光漂白能力。