一种发酵生产泛酸的基因工程菌、构建方法和用途与流程

本发明属于菌株发酵领域，具体涉及一种发酵生产泛酸的基因工程菌、构建方法和用途。

背景技术：

1、泛酸是各种生物体的必需营养物质，在合成辅酶a和蛋白质乙酰化等过程中起到关键作用。然而，自然条件下大肠杆菌及其他细菌的泛酸产量有限，无法满足工业生产的需求。

2、专利申请公布号为cn 111100834 a公开了一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株。其通过(1)加强 lpd基因的表达，(2)敲除 glk、 galp破坏葡萄糖非pts转运系统，加强 ptsg基因的表达而加强葡萄糖pts转运系统，(3)敲除 yfbq、 ppsa基因，(4)敲除 poxb、 pflb、 ldha基因，(5)敲除 ilve基因，(6)在质粒上引入异源的乙酰乳酸合酶基因 alss，(7)在质粒上引入异源的泛酸转运体 pant，最终得到最优的d-泛酸高产大肠杆菌基因工程菌株。d-泛酸效价从2.76g/l提高到6.33g/l。d-泛酸效价还需要进一步提升，以提质增效。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种发酵生产泛酸的基因工程菌、构建方法和用途，以进一步提高泛酸效价。

2、本发明实施例提供一种发酵生产泛酸的基因工程菌的构建方法，以菌株xhx-dpa为初始菌株，菌株xhx-dpa（大肠杆菌 escherichia coli）保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no. m 20231938，将初始菌株的 avta基因敲除，得到菌株xhx-dpa-02；

3、将菌株xhx-dpa-02的 glk基因敲除，得到菌株xhx-dpa-03；

4、将菌株xhx-dpa-03的 pta基因敲除，同时插入 alss基因，得到菌株xhx-dpa-04；

5、将菌株xhx-dpa-04的 laci基因敲除，同时插入 pane基因，得到菌株xhx-dpa-05；

6、降低菌株xhx-dpa-05中 ilve基因翻译效率，得到菌株xhx-dpa-06；

7、降低菌株xhx-dpa-06中 ilva基因翻译效率，得到菌株xhx-dpa-07；

8、将基因 panb和基因 panc插入质粒（优选为质粒pbr322），转化入菌株xhx-dpa-07，得到菌株xhx-dpa-08，所述菌株xhx-dpa-08为发酵生产泛酸的基因工程菌。

9、其中一个实施例中，得到菌株xhx-dpa-02的步骤中，用到的引物为seq id no.1-6， avta基因为seq id no.57。

10、其中一个实施例中，得到菌株xhx-dpa-03的步骤中，用到的引物为seq id no.7-12， glk基因为seq id no.58。

11、其中一个实施例中，得到菌株xhx-dpa-04的步骤中，用到的引物为seq id no.13-20， pta基因为seq id no.59， alss基因为seq id no.55。优选的，还包括通过启动子调控基因的表达，启动子为seq id no.63-65；更优选的，启动子为seq id no.65。

12、其中一个实施例中，得到菌株xhx-dpa-05的步骤中，用到的引物为seq id no.21-28， laci基因为seq id no.60， pane基因为seq id no.56。优选的，还包括通过启动子调控基因的表达，启动子为seq id no.63-65；更优选的，启动子为seq id no.64。

13、其中一个实施例中，得到菌株xhx-dpa-06的步骤中，引物为seq id no.29-34， ilve基因为seq id no.61。

14、其中一个实施例中，得到菌株xhx-dpa-07的步骤中，用到的引物为seq id no.35-40， ilva基因为seq id no.62；

15、得到菌株xhx-dpa-08的步骤中， panb基因为seq id no.53， panc基因为seq idno.54。

16、本发明实施例提供一种所述的构建方法得到的发酵生产泛酸的基因工程菌。

17、本发明实施例提供一种所述的基因工程菌在微生物发酵制备d-泛酸中的应用。

18、其中一个实施例中，发酵的培养基为葡萄糖15~25 g/l，硫酸铵10~15 g/l，磷酸氢二钾0.5~1.0 g/l，硫酸镁0.2~0.4 g/l，碳酸钙10-25 g/l，酵母粉2~5 g/l，β-丙氨酸2~3g/l；发酵温度为25-37℃，转速为100-900rpm。

19、本发明的有益效果是，本发明使用crispr-cas9系统敲除泛酸代谢途径中的代谢支路基因，并在相应位点插入关键酶基因；通过基因工程手段增加泛酸（维生素b5）途径中关键酶类的表达量；经过优化的发酵过程，显著提高泛酸的外源产量。

20、本发明通过基因编辑工具改造大肠杆菌( escherichia coli)的泛酸代谢途径（实施例2-8），从而显著提高其泛酸产量。通过使用crispr-cas9 系统精确敲除及敲降泛酸合成的代谢支路调节基因，并通过基因工程增强关键酶活性，从而实现对泛酸合成途径的控制和优化。

21、本发明将乙酰乳酸合成酶催化糖酵解关键中间产物丙酮酸转化为乙酰乳酸（实施例4），引导碳流流向缬氨酸和泛酸合成途径，强化了泛酸合成通路的前体供给。

22、本发明依据基因功能选择来源于不同种属的乙酰乳酸合成酶，经密码子优化后，于前述底盘中异源表达，检测其基因表达和蛋白表达水平，以及目标产物泛酸效价，评估各种属来源基因底盘适配性，通过筛选获得巨大芽孢杆菌来源的 alss基因具有最优的表型（实施例4）。

23、本发明将大肠杆菌中2-dehydropantoate由 pane基因编码的2-dehydropantoate2-还原酶和 ilvc基因编码的酮醇酸还原异构酶催化形成泛解酸（实施例5），由于ilvc底物谱广泛，催化多种还原异构反应，因此选择针对性的强化其中特异性较强的 pane基因，增强2-dehydropantoate转化为泛解酸。

24、本发明通过选择j23119系列不同强度的启动子，精细调控整合基因的代谢流，优化代谢平衡，提升产量（实施例4-5）。

25、本发明所使用底盘菌株为筛选所获得的非模式大肠杆菌菌株，其代谢特性异于常见的模式菌株 e.coliw3110，发酵过程中表现出高好氧高耗糖的性能，单位时间效价为0.95g/l/h（68.54 g/l除以72h得到），高于常规菌株的单位时间效价。