一种甲型流感/乙型流感核酸检测试剂盒的制作方法

本发明属于病毒检测，具体涉及一种甲型流感/乙型流感核酸检测试剂盒。

背景技术：

1、流感病毒属正粘病毒科(orthomyxoviridae)，病毒颗粒呈球状，直径为80nm-120nm，为单股负链rna病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。病毒结构自外而内可分为包膜、基质蛋白和核心三部分，核心包含病毒遗传物质单股负链rna，具有特异性。包膜上有3种膜蛋白——血凝素、神经氨酸酶和m2蛋白(丙型流感病毒没有m2蛋白)。血凝素能凝集多种动物红细胞，是决定病毒有无感染性的首要条件；神经氨酸酶能帮助病毒穿过呼吸道黏蛋白，并与上皮细胞结合，还能帮助子代病毒脱离感染细胞，有利于病毒的释放。

2、流感病毒按照核蛋白和基质蛋白的不同可分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行；乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。

3、甲型流感病毒为常见流感病毒，甲型流感病毒最容易发生变异，甲型流感病毒的亚型则被人们称为“禽流感”，禽流是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播，人员和车辆往来是传播本病的重要因素。

4、甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的；乙型和丙型流感仅在人之间传播，以局部暴发和散发流行为特征。

5、流感病毒主要传播途径是带有流感病毒的飞沫，经呼吸道进入体内。病毒传入人群后，传染性强并可迅速蔓延，传播速度和广度与人口密度有关。流感病毒感染导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成黏膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至下呼吸道，则可能引起毛细支气管炎和间质性肺炎。因此，做到甲型和乙型流感病毒的早诊断、早发现、早治疗十分关键。

6、流感病毒的检测方法主要有病毒的分离培养，免疫学诊断和分子生物学诊断。病毒的分离培养和免疫学诊断是流感的实验室诊断的常规方法，分子生物学诊断中出现了许多快速特异的方法，三种方法具有以下特点：

7、1)病毒分离培养对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，且各实验室分离阳性率各不相同，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要，目前仅用于实验研究。

8、2)血清学方法不能高通量处理样本，不能准确反映当前是否感染或携带病毒。血清学的诊断还存在滞后性，该方法费时、费力，无法满足快速、早期诊断的要求。

9、3)病毒核酸检测：由于以上两种方法费时、费力，为了提高检测速度，可直接从临床标本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或气管抽取物)中检测病毒的核酸。该方法具有快速性、准确性和高灵敏性等优点，能够对流感病毒感染作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。其中的实时定量rt-pcr检测平台已成为最简捷和可靠的流感病毒检测方法。

10、逆转录pcr/实时定量pcr的敏感度和特异度较高，是流感病毒、禽流感病毒等呼吸道病毒感染快速诊断的首选方法。尽管分子检测方法(如pcr)在诊断中表现出色，但在某些情况下，可能会出现假阴性或假阳性结果。特别是在病程早期或病毒载量较少的情况下，敏感性可能会受到限制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种甲型流感/乙型流感核酸检测试剂盒，以解决背景技术中的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一种甲型流感/乙型流感核酸检测试剂盒，试剂盒中包括：

4、(1)2×rt-pcr缓冲液；

5、(2)rt-pcr反应酶系；

6、(3)引物探针反应液；

7、(4)阴性对照；

8、(5)阳性对照。

9、进一步地，2×rt-pcr缓冲液中含有dntp(脱氧核糖核苷三磷酸)、镁离子、pcr缓冲液，dntp的浓度为5mm，镁离子的浓度为0.3mm。

10、进一步地，rt-pcr反应酶系中含有udg酶、逆转录酶、dna聚合酶，dna聚合酶的添加量为2u，逆转录酶的添加量为20u，udg酶的添加量为0.1u。

11、进一步地，引物探针反应液中含有甲型流感引物、甲型流感探针、乙型流感引物、乙型流感探针、内参rnasep引物、rnasep探针，其序列如seq id no：1-9所示。

12、进一步地，阴性对照为depc水。

13、进一步地，阳性对照中含有甲型流感病毒保守区域、乙型流感病毒保守区域、内参rnasep基因特异性片段的克隆质粒，序列如seq id no：10所示。

14、本发明进一步提供了利用上述试剂盒同时检测甲型流感和乙型流感核酸的检测方法，包括以下步骤：

15、(1)样品制备

16、提取待检测的rna样本，提取的rna样本可立即用于检测，若提取后不立即检测，也可存于-80℃保存备用。

17、(3)反应体系配置

18、反应液的配制：

19、将2×rt-pcr缓冲液、引物探针反应液、rt-pcr反应酶系置于冰上或者4℃条件下，融化后摇均，然后按照12.5μl∶1μl∶6.5μl的比例取2×rt-pcr缓冲液、rt-pcr反应酶系和引物探针反应液，加入离心管中，充分混匀、离心，得到pcr反应液，若待检样品数为n(包含阳性、阴性对照)，则按n+1个反应配制反应体系，防止加样损失导致反应体系不足，如下表所示；

20、 组分 1个反应添加量 (n+1)个反应体系添加量 2×rt-pcr反应液 12.5μl 12.5μl×(n+1) rt-pcr反应酶系 1μl 1μl×(n+1) 引物探针反应液 6.5μl 6.5μl×(n+1)

21、体系分装：

22、将配制好的pcr反应液进行分装，按照20μl的添加量分装于荧光pcr仪适用的pcr管中；

23、样品检测：

24、在装有pcr反应液的pcr管中分别加入步骤(1)提取后的待测样rna样本、阴性对照、阳性对照各5μl，终体积为25μl，盖紧管盖，得到反应管。

25、(3)上机检测

26、将步骤(2)获得的反应管放入荧光pcr检测仪中，按照以下程序上机检测，程序参数设定如下表所示：

27、

28、注：60℃时荧光检测，检测通道为fam、vic、cy5。

29、(4)结果分析

30、反应结束后，仪器自动保存结果，阴性对照无曲线扩增，且阳性对照fam、vic、cy5三个通道均有曲线扩增(ct≤30)，实验成立，否则视为结果无效；

31、若样品有s型扩增且ct值≤35则判定该通道反应阳性(+)；

32、若ct值>38或未检出则判定该通道反应阴性(-)；

33、若有s型扩增且35＜ct值≤38则为不确定样品，需重新提取核酸后再次检测。

34、具体结果的判定方法如下表所示：

35、

36、本发明的有益效果：

37、本发明提供的试剂盒适用于定性检测鼻咽拭子和痰样本中甲型/乙型流感病毒rna，基于实时荧光pcr技术，通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定性的分析，分别选取人感染甲型流感病毒的m基因和感染乙型流感病毒的np基因的保守区作为扩增靶区域，人类rnasep管家基因作为内参靶序列，设计特异性引物和探针，通过一步法实时荧光pcr体系扩增，对人感染甲型/乙型流感病毒进行定性检测，敏感度高，对甲型流感病毒最低检测限ct值为32.6，滴度约为0.6×10-4tcid50，对乙型流感病毒最低检测限ct值为35.6，滴度约为0.7×10-5tcid50，且在检测体系中加入了人源基因的检测作为内参，能够提示采样及核酸提取过程是否正常，避免因采样不合格或者核酸提取操作失误而引入的假阴性结果，能够做到不漏检、不多检，同时，通过调整体系各组分和比例，实现快速检测的目的。