GmSTOP1-3基因在调节大豆根系黄酮类物质的合成代谢与减少植物ROS积累中的应用

本发明属于基因工程与植物育种。更具体地，涉及gmstop1-3基因在调节大豆根系黄酮类物质的合成代谢与减少植物ros积累中的应用。

背景技术：

1、铝(al)是地壳含量最高的金属元素之一。其在土壤的有效性取决于土壤ph值，当土壤ph值低于5，土壤溶液中的铝主要以al3+的形态存在。al3+对植物的毒害作用主要包括抑制植物的根系生长和发育、限制水分和养分的吸收、阻碍光合作用、促进活性氧(ros)的积累等。因此，铝成为酸性土壤中影响作物生产的关键限制因素之一。

2、在长期进化过程中，植物形成了多种适应铝胁迫的机制。这些机制主要分为外部排斥和内部忍耐机制。外部排斥机制主要通过分泌有机酸、粘液、以及改变根际ph值等，导致土壤中的al3+或与分泌物形成稳定的络合物，或改变其形态，从而阻碍al3+进入根尖细胞。其中，铝诱导的有机酸的分泌在植物的外部排斥机制中研究较为深入。以拟南芥为例，铝诱导的苹果酸转运蛋白atalmt1介导了拟南芥根系大部分的苹果酸分泌。据估计，atalmt1控制了拟南芥约70％的耐铝能力。虽然外部排斥机制将大部分的铝阻碍在原生质体外，但小部分铝仍然能够穿过层层屏障，进入原生质体。进入细胞的al3+主要通过液泡的区室化以及向地上部的转移等方式，减少细胞内铝的累积。植物铝的内部忍耐机制的另一个重要途径是抗氧化防御。铝进入细胞后，由铝诱发产生的过量ros会导致线粒体功能障碍、酶失活、细胞壁伸展性降低和质膜过氧化。亚细胞器官的功能障碍最终导致细胞死亡和根生长抑制。因此，消除ros和恢复ros引起的损伤成为内部忍耐机制的重要部分。

3、ros的累积增加通常伴随着ros清除酶活性的增强和它们编码基因的诱导。在大豆中，已发现超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)和过氧化氢酶(cat)的活性由于铝毒而增加，尤其是在耐铝大豆基因型中。除了上述的超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)和过氧化氢酶(cat)等，异黄酮类化合物、谷胱甘肽、抗坏血酸、类胡萝卜素和α-生育酚也是重要的超氧化物清除物质。其中，异黄酮类化合物是苯丙氨酸途径的次级代谢物。异黄酮化合物之一染料木素具有较强的抗氧化和清除自由基活性，在植物应对生物和非生物胁迫的过程中至关重要。

4、植物stop1是一类锌指蛋白转录因子。stop1可通过调控almt1、mate和als3等多个耐受铝毒相关基因的表达缓解铝毒害。stop1同源基因参与耐铝毒机制在多种植物已被报道，包括水稻、玉米、番茄、木豆、高粱、苹果、烟草、大豆、棉花、黑麦、饭豆和小麦等。如现有研究显示回补表达gmstop1-1和gmstop1-3可以部分恢复atstop1突变体的铝耐受能力。虽然其他植物中stop1调控根系适应铝毒害的生物学功能的研究已取得较多的进展，但stop1同源基因在大豆耐铝毒的功能及其调控机制尚不清楚，对于大豆的生长调节作用也未可知。因此，有必要研发出更多的基因资源对大豆适应铝胁迫环境及其生长调节提供依据，为开发耐铝植株与适应酸性土壤铝毒害的大豆品种提供支持。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有大豆调控适应铝胁迫环境的基因的不足，提供gmstop1-3基因在调节大豆根系黄酮类物质合成代谢与减少植物ros积累中的应用。

2、本发明的目的是提供gmstop1-3基因的新应用。

3、本发明另一目的是提供促进gmstop1-3基因表达的制剂的应用。

4、本发明又一目的是提供一种提高大豆超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量、或减少植物ros积累、或增强植物铝耐受性的方法。

5、本发明还一目的是提供一种培育铝耐受植株、或高超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量的植株的方法。

6、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

7、本发明对大豆锌指蛋白转录因子gmstop1-3基因进行了系统的功能分析，gmstop1-3基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，其氨基酸序列如seq id no:2所示。研究显示gmstop1-3具有参与调节大豆根系铝耐受的功能作用，正调节大豆根系黄酮类物质的合成代谢，gmstop1-3主要在根中表达，在铝胁迫中上调表达，能显著增加植物超氧化物歧化酶(sod)和过氧化物酶(pod)；通过超量表达载体的构建与黄酮类定量代谢组学分析，明确过表达gmstop1-3影响黄酮类物质的代谢过程，调节大豆根系黄酮类物质含量，提高染料木素含量，减少植物ros积累，恢复ros引起的植物损伤，增强大豆铝耐受性，降低植物的铝含量，为消除植物ros以及培育铝耐受植株提供更多有效方法，这对阐明stop1基因在豆科作物适应铝毒害调控的生物学功能有着重要意义，旨在为开发更多适应酸性土壤铝毒害的大豆品种提供理论支持。

8、因此，本发明提供gmstop1-3基因的以下应用：

9、在正调节大豆根系黄酮类物质的合成代谢中的应用。

10、在提高大豆超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量，或减少植物ros积累中的应用。

11、在增强大豆铝耐受性中的应用。

12、在制备调节大豆根系黄酮类物质合成代谢的制剂，或铝耐受制剂中的应用。

13、进一步地，所述黄酮类物质为：quercetin(槲皮素)、dihydrokaempferol(二氢山柰酚)、apigenin-7-glucuronide(芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷)和nicotiflorin(烟花素)、isobavachalcone(异补骨脂查尔酮)、acacetin(乙酰乙酸)、corylin(补骨脂异黄酮)、prunetin(樱黄素)、(-)-catechin gallate((-)-儿茶素没食子酸酯)、narcissin(水仙苷)、quercimeritrin(槲皮素-7-o-β-d-葡萄糖苷)、diosmetin(香叶木素)、nobiletin(移动素)、silychristin(水飞蓟亭)、tangeretin(桔梗素)、neobavaisoflavone(新补骨脂异黄酮)、tiliroside(银锻苷)、echinatin(刺甘草查尔酮)、genistein(染料木素)、quercetin(槲皮素)、naringenin-7-glucoside(柚皮素7-o-葡萄糖苷)、2'-hydroxygenistein(2',4',5,7-四羟基异黄酮)、daidzein(黄豆苷元)、formononetin(甲羧黄酮)、isomangiferin(异芒果苷)、narcissin(水仙苷)、corylin(补骨脂异黄酮)、6-methylflavone(6-甲基黄酮)、luteolin(木犀草素)、tangeretin(桔皮素)、baimaside(白茅甙)、silychristin(水飞蓟亭)、rutin(芦丁)和tiliroside(银锻苷)。

14、优选地，所述调节为增加quercetin(槲皮素)、dihydrokaempferol(二氢山柰酚)、apigenin-7-glucuronide(芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷)、nicotiflorin(烟花素)、isobavachalcone(异补骨脂查尔酮)、echinatin(刺甘草查尔酮)、genistein(染料木素)、quercetin(槲皮素)、naringenin-7-glucoside(柚皮素7-o-葡萄糖苷)、2'-hydroxygenistein(2',4',5,7-四羟基异黄酮)、daidzein(黄豆苷元)和formononetin(甲羧黄酮)的含量。

15、本发明提供促进gmstop1-3基因表达的制剂在制备提高植物染料超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或木素含量制剂，减少植物ros积累制剂，或增强植物铝耐受性制剂中的应用。

16、本发明提供促进gmstop1-3基因表达的制剂在制备消除植物ros和/或恢复ros引起的植物损伤的产品中的应用。

17、本发明提供促进gmstop1-3基因表达的制剂在制备调节植物根系黄酮类物质含量，或在制备提高植物超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量，减少植物ros积累，或增强植物铝耐受性的产品中的应用。

18、本发明提供gmstop1-3基因或其促进表达的制剂在培育铝耐受植株，或高超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量的植株中的应用。

19、优选地，促进gmstop1-3基因表达的制剂为促进gmstop1-3基因表达的质粒、载体、或重组菌。

20、本发明提供一种提高大豆超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量、或减少植物ros积累、或增强植物铝耐受性的方法，采用促进gmstop1-3基因表达的制剂对植物进行处理，或将含过表达gmstop1-3基因的重组载体导入植株中。

21、本发明还提供一种培育铝耐受植株、或高超氧化物歧化酶、过氧化物酶和/或染料木素含量植株的方法，在植物中过表达gmstop1-3基因，或将含过表达gmstop1-3基因的重组载体导入植株中。

22、优选地，gmstop1-3基因的表达载体，可用于现有的植物表达载体构建含有基因gmstop1-3的重组表达载体；植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如ptf101s或其它衍生植物表达载体。

23、优选地，所述重组表达载体可通过例如农杆菌介导的转化法转化到植物中。

24、本发明还涉及含有超量表达gmstop1-3基因的细胞，包含gmstop1-3基因或重组载体；细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

25、本发明涉及的植物可以为植物部分、植物材料、植物种子，所述植物为豆科植物，如菜豆和大豆；也可以是其它植物，如单子叶植物，如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等；或者其他双子叶植物，如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。

26、本发明具有以下有益效果：

27、本发明提供提供gmstop1-3基因在调节大豆根系黄酮类物质合成代谢与减少植物ros积累中的应用，研究显示gmstop1-3具有参与调节大豆根系铝耐受的功能作用，正调节大豆根系黄酮类物质的合成代谢，gmstop1-3在铝胁迫中上调表达，能显著增加植物超氧化物歧化酶(sod)和过氧化物酶(pod)；通过超量表达载体的构建与黄酮类定量代谢组学分析，明确过表达gmstop1-3影响黄酮类物质的代谢过程，调节大豆根系黄酮类物质含量，提高染料木素含量，减少植物ros积累，恢复ros引起的植物损伤，增强大豆铝耐受性，降低植物的铝含量，为消除植物ros以及培育铝耐受植株提供更多有效方法，这对阐明stop1基因在豆科作物适应铝毒害调控的生物学功能有着重要意义，旨在为开发更多适应酸性土壤铝毒害的大豆品种提供理论支持。