一种alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸相连多肽序列的固相合成方法与流程

本发明属于多肽药物制备领域，具体涉及一种alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸相连多肽序列的固相合成方法。

背景技术：

1、含连续大位阻氨基酸的多肽序列，在进行多肽固相逐步法连接时，由于其位阻效应，连接非常困难。而在含连续大位阻多肽序列中，一种从多肽序列氨基端到羧基端相连氨基酸依次为alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸的多肽序列，在多肽固相合成中，连接尤为困难。目前已经报道的合成方法都无法有效的解决该类序列的连接问题。

2、因此，还需要开发alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸相连多肽序列的合成方法。

3、微波是频率约在300mhz～300ghz范围内的电磁波。目前，微波在有机合成中的应用已经得到了广泛而深入的研究。在反应中，微波表现出了加快反应速度，提高反应转化率等优点。目前认为，微波参与的有机反应机理主要有两种。一种是微波加热反应，促进反应的进行；一种是微波能够对有机合成的反应实现催化，降低反应物的活化能，促进反应动力学。

4、研究表明，微波在多肽固相合成中，同样表现出了加快反应速度，提高反应转化率等优点。基于微波在多肽固相合成中的特点，所以目前微波反应器已经被成功应用到疏水性多肽序列的固相合成当中。而微波辅助含连续大位阻多肽序列的连接方法目前鲜有报道。

技术实现思路

1、在实际的研究中，发明人发现一类从多肽序列氨基端到羧基端相连氨基酸依次为alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸的多肽序列在多肽固相连接时由于其连续的位阻效应，连接尤为困难，目前并无报道该类序列的有效连接方法。基于微波在固相多肽合成中的应用，发明人大量研究了不同种类的缩合试剂，以及结合微波反应器的特点，开发了一种微波辅助氨基端到羧基端相连氨基酸依次为alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸的多肽序列在固相上的连接方法。

2、本发明的方法简述为：采用sieber酰胺树脂为起始原料，在沙星反应器中按照多肽序列采用fmoc固相逐步法进行氨基酸连接直到氮烷基类甘氨酸，然后脱除fmoc保护基，接着将fmoc-alpha取代氨基酸和缩合试剂或偶联试剂加入并在微波反应器中进行连接，待该fmoc-alpha氨基酸连接成功后将肽树脂从微波反应器中取出，再在沙星反应器中完成剩余氨基酸的连接，直到得到全保护肽树脂。接着在低浓度tfa条件下对全保护肽树脂进行切割脱除保护基得直链肽粗品，再经环化纯化冻干得目标产品。

3、具体来说，本发明提供以下技术方案：

4、一方面，本发明提供由式i表示的alpha取代氨基酸和氮烷基类甘氨酸相连多肽序列的合成方法，所述方法包括将带保护基团的alpha取代氨基酸与含有氮烷基类甘氨酸的肽序列以2-肟氰乙酸乙酯(oxyma)和二异丙基碳二亚胺(dic)为偶联试剂在微波辅助下进行反应的步骤：

5、an-alpha取代氨基酸-氮烷基类甘氨酸-bn(式i)

6、其中a、b各自代表氨基酸残基，n为0或不大于30的整数。

7、在一些实施方案中，n为不大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的整数。

8、在一些实施方案中，所述氨基酸残基为修饰的氨基酸残基或不带有修饰的氨基酸残基，或所述氨基酸残基为天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

9、在一些实施方案中，所述alpha取代氨基酸为alpha烷基取代氨基酸。

10、在一些实施方案中，所述alpha烷基取代氨基酸为alpha甲基取代氨基酸。

11、在一些实施方案中，alpha甲基取代氨基酸为alpha甲基取代苯丙氨酸或alpha甲基取代丙氨酸。

12、在一些实施方案中，所述氮烷基类甘氨酸中的烷基取代基为一个或多个。

13、在一些实施方案中，所述氮烷基类甘氨酸包括但不限于氮甲基甘氨酸、氮乙基甘氨酸、氮异丙基甘氨酸、氮异丁基甘氨酸和氮甲基丁基甘氨酸。

14、在一些实施方案中，所述氮烷基类甘氨酸选自氮甲基甘氨酸、氮乙基甘氨酸、氮异丙基甘氨酸、氮异丁基甘氨酸和氮甲基丁基甘氨酸。

15、在一些实施方案中，微波反应的温度为25-75℃，优选50℃。

16、在一些实施方案中，微波反应的时间为1-3小时，优选2小时。

17、在一些实施方案中，微波的功率为150-400w。

18、在一些实施方案中，微波的频率为50-2450mhz。

19、在一些实施方案中，氨基酸残基与oxyma、dic的用量相同或不同。

20、在一些实施方案中，氨基酸残基与oxyma、dic的摩尔比为1:1:1至1:1.5:2。

21、在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：

22、1)以树脂为起始原料，逐步合成带一个或多个保护基团的第一肽序列，即带一个或多个保护基团的氮烷基类甘氨酸-bn；

23、2)以oxyma和dic为偶联试剂在微波辅助下将带保护基团的alpha取代氨基酸连接到带一个或多个保护基团的第一肽序列上，获得带一个或多个保护基团的第二肽序列；

24、3)在带一个或多个保护基团的第二肽序列上逐步连接带一个或多个保护基团的an序列，获得带一个或多个保护基团的第三肽序列；

25、4)用裂解试剂裂解带一个或多个保护基团的第三肽序列，脱除所述一个或多个保护基团并将肽序列从树脂上解离出来，获得目标产物。

26、在一些实施方案中，所述树脂为sieber酰胺树脂。

27、在一些实施方案中，氨基酸原料为带有fmoc保护基团的氨基酸。

28、在一些实施方案中，步骤1)和步骤3)均为固相肽合成方法。

29、在一些实施方案中，步骤1)和步骤3)使用的偶联试剂相同或不同。

30、在一些实施方案中，步骤1)中使用的偶联试剂为hobt和dic。

31、在一些实施方案中，步骤3)中使用的偶联试剂为hobt和dic。

32、在一些实施方案中，氨基酸与hobt、dic的摩尔比为1:1:1至1:1.5:2。

33、在一些实施方案中，步骤4)的裂解试剂包括二氯甲烷、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷。

34、在一些实施方案中，二氯甲烷、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇和三异丙基硅烷的体积比为50-70:48.5-28.5:0.75:0.75。

35、在一些实施方案中，二氯甲烷、三氟乙酸、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷的体积比为70:28.5:0.75:0.75。

36、在一些实施方案中，以茚三酮法检测判断步骤1)至步骤3)中的各个偶联反应终点。

37、在一些实施方案中，若目标产物为环肽，则所述方法还包括对步骤4)获得的肽序列进行环化的步骤。

38、另一方面，本发明提供肽序列，其通过如上所述的方法获得。

39、在本发明中，保护基团为本领域常规保护基团，例如fmoc、叔丁基、三苯甲基、叔丁氧基、叔丁氧羰基、2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酸基。

40、在本发明中，天然氨基酸包括：丙氨酸(ala或a)，精氨酸(arg或r)，天冬酰胺(asn或n)，天冬氨酸(asp或d)，半胱氨酸(cys或c)，谷氨酰胺(gln或q)，谷氨酸(glu或e)，甘氨酸(gly或g)，组氨酸(his或h)，异亮氨酸(ile或i)，亮氨酸(leu或l)，赖氨酸(lys或k)，甲硫氨酸(met或m)，苯丙氨酸(phe或f)，脯氨酸(pro或p)，丝氨酸(ser或s)，苏氨酸(thr或t)，色氨酸(trp或w)，酪氨酸(tyr或y)，缬氨酸(val或v)。

41、在发明中，肽的氨基酸序列是依常法以氨基末端(也称为n端)位于左侧，羧基末端(也称为c端)位于右侧的方式加以记载。

42、另一方面，本发明提供模板肽cyclo(sac-phe-pro-alphamephe-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr-ile-thr-cys)-ile-nh2的合成方法，包括：

43、步骤1)按照序列利用固相法合成全保护的序列一：h-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr(tbu)-ile-thr(tbu)-cys(trt)-ile-sieber酰胺树脂。

44、步骤2)序列一与fmoc-alphamephe-oh在固相上合成序列二：h-alphamephe-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr(tbu)-ile-thr(tbu)-cys(trt)-ile-sieber酰胺树脂。

45、步骤3)序列二在固相中根据模板肽序列合成序列三：clac-phe-pro-alphamephe-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr(tbu)-ile-thr(tbu)-cys(trt)-ile-sieber酰胺树脂。

46、步骤4)酸解脱除侧链保护基得到clac-phe-pro-alphamephe-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr-ile-thr-cys-ile-nh2粗品，经液相硫醚环化、纯化冻干后得到模板肽cyclo(sac-phe-pro-alphamephe-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr-ile-thr-cys)-ile-nh2纯品。

47、作为优选，所述步骤2)缩合反应条件为：在微波合成仪中，以缩合试剂dic,oxyma为偶联试剂，实现fmoc-alphamephe-oh与全保护序列一h-(n(3-methylbutyl)gly)-tyr(tbu)-ile-thr(tbu)-cys(trt)-ile-sieber酰胺树脂的连接。

48、作为优选，步骤4)中所用的裂解试剂包括二氯甲烷，三氟乙酸，1,2-乙二硫醇，三异丙基硅烷。更为优选，裂解试剂的体积比为二氯甲烷：三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：三异丙基硅烷＝70:28.5:0.75:0.75。

49、定义

50、肽：由氨基酸和/或氨基酸类似物的酰胺键合或酯键合而形成。肽可以是线性肽或环肽。环肽可以由线性肽环化而成。

51、烷基：指的是单独地由碳原子和氢原子组成的、不包含不饱和度的直链的或支链的烃链基团例如，c1-c15烷基、c1-c13烷基、c1-c8烷基、c1-c5烷基、c1-c4烷基、c1-c3烷基、c1-c2烷基、c1烷基、c5-c15烷基、c5-c8烷基、c2-c5烷基、c3-c5烷基。例如，烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、1-甲基乙基(异丙基)、1-丁基(正丁基)、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-戊基(正戊基)、正丙基、正丁基、异丙基、叔丁基、戊基和己基。例如，烷基选自甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、1-甲基乙基(异丙基)、1-丁基(正丁基)、1-甲基丙基(仲丁基)、2-甲基丙基(异丁基)、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、1-戊基(正戊基)、正丙基、正丁基、异丙基、叔丁基、戊基和己基。

52、alpha烷基取代氨基酸：与羧基相连碳原子上的氢原子被其他烷基如甲基、乙基、异丙基、异丁基等取代的氨基酸。如alphame苯丙氨酸、alphame丙氨酸。

53、氮烷基类甘氨酸：如氮甲基甘氨酸、氮乙基甘氨酸、氮异丙基甘氨酸、氮异丁基甘氨酸、氮甲基丁基甘氨酸。

54、fmoc：其是一种保护基团，用于保护氨基酸中的氨基。在合成多肽链时，通过添加fmoc基团来保护氨基酸，以防止其在反应中发生不必要的反应或交联。

55、全保护序列：指多肽连接完成后含有侧链保护基的序列。

56、固相肽合成：也称为spps或merrifield合成，是由诺贝尔奖获得者robert brucemerrifield于1962年引入的一种肽合成方法，其中使用了不溶性聚合物载体。线性肽是通过逐步连接序列特异性的、临时保护的氨基酸来构建的，其中生长的多肽链的c端与合成树脂载体共价连接。为确保受控反应并避免副反应，氨基酸的反应性功能侧链必须由合适的保护基团封闭。虽然要连接的氨基酸的α-氨基只需要在实际的偶联反应期间受到保护，但永久性侧链保护基团仅在合成完成后才从肽中切割。与核糖体蛋白质生物合成相反，肽链的延伸从c端发生到n端。