一种来源于人体肠道微生物的稀土金属依赖性乙醇脱氢酶的用途

本发明涉及一种稀土金属依赖性蛋白，具体涉及一种来源于人体肠道微生物的稀土金属依赖性乙醇脱氢酶的用途。属于基因工程。

背景技术：

1、稀土金属(rare earth metals，简称rems)是镧系元素(从镧到镥共15种元素组成)和钪、钇共十七种金属元素的总称。根据其物理和化学的可分离性及离子半径大小，rems可分为轻稀土金属(light rare earth metals，简称lrems)和重稀土金属(heavyrare earth metals，简称hrems)。虽然被称为稀土金属，但它们在环境中并不稀少，其平均浓度占地壳的0.015％，和金属铜的含量相当。中国作为目前唯一一个能够提供全部稀土金属的国家，在稀土金属的资源储量、产量和销量上都占据世界第一。稀土金属作为宝贵的战略资源，广泛应用于尖端科技领域和军工领域，是各类高新技术产业不可缺少的原材料，素有“工业维生素”之称。

2、稀土金属的高效分离提纯是稀土资源高效利用和发展新质生产力的重要保障。传统的湿法冶金(液-液萃取法)技术不但成本高、效率低、对健康和环境有害，更重要的是分离得到的稀土金属纯度不高，因此，开发高效环保且适应广泛的稀土金属分离提纯技术具有重要意义。

3、近年来，生物采矿策略受到越来越多的关注，但由于金属提取微生物和清除大分子工具不足，可持续地分离提纯自然界中的稀土金属仍然存在巨大挑战。作为第一个被发现可与稀土金属直接结合的蛋白质，醇脱氢酶xoxf与exaf/pedh的多样性高、分布广泛、金属选择性差异显著，有望成为分离提纯稀土金属的生物采矿技术中的关键生物分子之一。因此，筛选具有独特性质的醇脱氢酶将为开发新型稀土金属生物分离技术提供重要理论基础与技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种来源于人体肠道微生物的稀土金属依赖性乙醇脱氢酶的用途。

2、为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

3、一种来源于人体肠道微生物的稀土金属依赖性乙醇脱氢酶exaf_m.r.、携带该乙醇脱氢酶的编码基因的载体、或者利用该载体转化或转染的宿主细胞在稀土金属离子分离中的应用；

4、其中，所述乙醇脱氢酶exaf_m.r.的氨基酸序列如seq id no.2所示；或者对seqid no.2所示的序列，远离金属结合位点e198(198位谷氨酸)、n275(275位天冬酰胺)、d317(317位天冬氨酸)、d319(319位天冬氨酸)位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有exaf_m.r.活性的衍生蛋白质；

5、所述编码基因具有以下任意一种核苷酸序列：

6、(1)与seq id no.1所示序列一致；

7、(2)对seq id no.1所示序列进行取代、添加和/或缺失一个或两个以上核苷酸但能获得编码保留exaf_m.r.蛋白生物学特性的突变基因。

8、优选的，所述衍生蛋白质至少与seq id no.2所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性。

9、进一步优选的，所述衍生蛋白质至少与seq id no.2所示的氨基酸序列具有95％以上的同源性。

10、更进一步优选的，所述衍生蛋白质至少与seq id no.2所示的氨基酸序列具有99％以上的同源性。

11、优选的，所述突变基因至少与seq id no.1所示序列具有90％以上的同源性。

12、进一步优选的，所述突变基因至少与seq id no.1所示序列具有95％以上的同源性。

13、更进一步优选的，所述突变基因至少与seq id no.1所示序列具有99％以上的同源性。

14、优选的，所述宿主细胞为原核生物或真核生物细胞。

15、进一步优选的，所述宿主细胞为细菌、真菌或哺乳动物细胞。

16、更进一步优选的，宿主为大肠杆菌或工程菌methylobacterium extorquens am1。

17、更进一步优选的，宿主为工程菌methylobacterium extorquens am1。

18、优选的，所述的稀土金属离子包括：la3+、ce3+、pr3+、nd3+、pm3+、sm3+、eu3+。

19、优选的，所述的稀土金属离子包括：gd3+、tb3+、dy3+、ho3+、er3+、tm3+、yb3+、lu3+、sc3+、y3+。

20、优选的，所述乙醇脱氢酶exaf_m.r.催化醇或醛水解；所述的醇选自：甲醇，乙醇，正丙醇，正丁醇，正戊醇，正己醇，异丙醇；所述的醛选自：甲醛，乙醛。

21、进一步优选的，所述乙醇脱氢酶exaf_m.r.催化乙醇水解。

22、更进一步优选的，所述乙醇脱氢酶exaf_m.r.催化乙醇水解的温度为20～80℃，ph为6.0～10.0。

23、更进一步优选的，所述乙醇脱氢酶exaf_m.r.催化乙醇水解得温度为20～60℃，ph为8.0～9.0(维持60％以上活性)。

24、本发明的有益效果：

25、本发明涉及一种来源于人体肠道微生物methylobacterium rhodesianumdsm5687的稀土金属依赖性乙醇脱氢酶exaf_m.r.及其编码基因与应用，利用pcr扩增技术合成稀土金属依赖性蛋白的基因exaf，发现该基因编码的蛋白具有优良的酶学特性，具有与稀土金属结合的优良特性，在rems(轻稀土金属)存在时，酶活性能显著提高；与其他稀土依赖性蛋白不同的突出特点是，exaf_m.r.在hrems(重稀土金属)存在的情况下仍能保持较高的活性(表1)，表明该蛋白不仅能结合轻稀土金属，还能结合重稀土金属。本发明获得的稀土金属依赖性蛋白的基因exaf可克隆到合适的宿主中实现表达，实现工业化生产稀土金属依赖性蛋白，为后续的稀土金属的生物分离技术提供可供改造的生物大分子，提供成本低廉的稀土金属依赖性蛋白原始材料。同时，exaf_m.r.的特殊稀土金属选择性扩宽了人们对rems生物采矿、生物浸出和回收过程应用前景的认识，为开发环境友好型生物技术高效分离稀土金属提供理论基础，具有重要的经济和社会价值。

26、表1

27、

28、本发明通过特异性底物(乙醇)筛选获得一种新的稀土金属依赖性蛋白exaf_m.r.的基因，经pcr、酶切、同源重组和测序，稀土金属依赖性蛋白exaf_m.r.的核苷酸序列如seqid no.1所示。稀土金属依赖性蛋白exaf_m.r.的基因大小为1764bp，碱基组成为：336a(19.05％)、253t(14.34％)、606c(34.35％)和569g(32.26％)，编码蛋白含587个氨基酸残基，其氨基酸序列如seq id no.2所示，获得的稀土金属依赖性蛋白可以水解多种醇类和醛类，当底物为乙醇时催化活性最高，酶活vmax为0.99u/mg，米氏常数km为0.018mm。

29、该稀土金属依赖性乙醇脱氢酶在ph 8.0-ph 9.0条件下，能够保持60％以上的活性。此外，在添加大部分金属离子的反应体系中仍保持活性，特别是在添加稀土金属后，酶学活性显著提高。而且，在低浓度有机溶剂中也存在活性。该稀土金属依赖性蛋白能水解多种醇类和醛类，并且对于乙醇的水解能力最强，且能稳定在微生物中被提取纯化，在生物冶金等化工领域应用广泛。

30、将该基因序列在genbank中进行同源搜索，与之相似性最高的稀土金属依赖性乙醇脱氢酶来源于bacteria；pseudomonadota；alphaproteobacteria；hyphaproteobacteria；hyphomicrobiales；methylobacteriaceae；methylorubrum；methylorubrum populi，相似性为97.72％(其在genbank数据库中的注册号为ap014809.1)。系统发育分析结果表明，该稀土金属依赖性蛋白属于pqq依赖性醇脱氢酶家族。氨基酸多序列比对分析结果显示，该稀土金属依赖性蛋白具有由e198(198位谷氨酸)、n275(275位天冬酰胺)、d317(317位天冬氨酸)和d319(319位天冬氨酸)组成的稀土金属结合位点。综上所述，该蛋白exaf_m.r.应为稀土金属依赖性乙醇脱氢酶家族中的一名新成员。

31、在不影响该蛋白与稀土金属结合特性的前提下，可对seq id no.2所示的金属结合位点e198、n275、d317、d319等进行各种氨基酸替换、增添和/或缺失一个或几个氨基酸获得保持或提高稀土金属结合特性的其它衍生蛋白质。一般来说，蛋白质的生物学活性和其功能结构域是密切相关的。只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二级和三级结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于非功能结构域的氨基酸位点突变，并不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。

32、利用分子克隆技术，将稀土金属依赖性酶基因全长1764bp连接到改良后的pcm80(+)载体上(marx c j,lidstrom m e.development of improved versatile broad-host-range vectors for use in methylotrophs and other gram-negative bacteria[j].microbiology,2001,147(8):2065-2075.)，使用接合法转化到工程菌methylobacteriumextorquens am1高效表达融合蛋白稀土金属依赖性乙醇脱氢酶exaf_m.r.。本发明优先选择了使用甲基营养工程菌的原核细胞表达系统。

33、将本发明筛选到的稀土金属依赖性蛋白基因通过pcr扩增后，通过同源重组连接到可溶性表达载体pcm80(+)上，使用接合法转化到工程菌methylobacterium extorquensam1中，转接重组表达菌株于含有10μg/ml四环素的hypho液体培养基中，30℃，180rpm/min振荡培养至od600达到0.8时加入体积浓度为0.15％的无水乙醇和30μm ce3+进行诱导表达，30℃，180rpm/min振荡培养20小时后通过5,000rpm/min离心收集细菌，将离心收集的可溶性表达菌体以适量缓冲液(100mm tris,ph 9.0；150mm nacl；5mm咪唑；1mm dtt；0.2mmpmsf)悬菌，使用超声破碎仪裂解菌体，以11,000rpm/min高速离心15分钟去除沉淀。将离心后上清液与ni-nta亲和介质结合后，用100mm tris,ph 9.0；150mm nacl；30mm咪唑；1mmdtt；0.2mm pmsf的缓冲液冲洗介质，去除杂蛋白。最终用100mm tris,ph 9.0；150mm nacl；250mm咪唑；1mm dtt的洗脱液将目的蛋白从亲和介质上洗脱下来，以50kda截留的浓缩管将洗脱液浓缩。将浓缩后的蛋白溶液进一步用凝胶过滤层析(superdex200，16/600)的方法纯化，使用的缓冲液为100mm tris,ph 9.0；150mm nacl；1mm dtt。得到高活性的exaf_m.r.。通过dcpip法活力测定表明，该稀土金属依赖性蛋白或上述能表达稀土金属依赖性蛋白的宿主菌在稀土金属存在的情况下可利用乙醇。

34、稀土金属依赖性蛋白催化乙醇水解温度范围为20℃-80℃，优选温度为20℃-60℃(维持60％以上活性)；所述水解的ph值为ph 6.0-ph 10.0，优选ph值为ph 8.0-ph 9.0(维持60％以上的活性)。在添加稀土金属条件下，酶学活性增大；对有机溶剂具有一定的耐受性。