一种硝酸纤维素蛋白印迹膜及其制备方法和应用与流程

本发明涉及膜材料的制备及其应用领域，具体涉及一种硝酸纤维素蛋白印迹膜及其制备方法和应用，特别适用于蛋白印迹测定及分析。

背景技术：

1、western blot(也称为蛋白质免疫印迹)是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术，它利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到多孔膜上，之后将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉后只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显色反应或荧光扫描来检测结合的抗体。由于抗体仅与目标蛋白质结合，因此一般只能看到一条清晰的带，条带的粗细对应于蛋白质量，通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。

2、常用于印迹测定的膜类型包括硝酸纤维素(nc)膜、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜和尼龙膜。然而，每种膜都具有限制其在上述应用中的实用特性。尼龙膜与生物分子紧密结合，因此具有较低的信噪比。聚偏二氟乙烯膜使用前需要活化(膜需要先进行甲醇或乙醇预湿步骤，然后进行水交换去除甲醇或乙醇)，并且不能用于需要促进生物分子结合的表面活性或需要高侧向流速的应用。

3、相比于尼龙膜和pvdf膜，硝酸纤维素膜具有良好水浸润性和广泛的易用性，使其在免疫检测测定工作中无处不在，特别是在蛋白质印迹中有着特别广泛的应用。

4、目前针对于硝酸纤维素的制备方法如下：将硝酸纤维素溶解在常规溶剂和非溶剂中，然后涂覆在平坦的表面上(如光滑洁净的玻璃板表面或者未经处理、光学透明的聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)基带上)，并控制一定的温湿度使溶剂和非溶剂完全挥发后，得到初生的硝酸纤维素多孔膜，最后将其烘干处理以最终得到成品。然而由于硝酸纤维素是通过天然纤维素的硝化作用制备，而在硝化过程中会由于纤维素的部分硝化，导致会产生广泛分布的异质低聚物和聚合物硝酸盐等产物，导致硝酸纤维素在成膜过程中难以形成较均匀的连续网格结构，甚至难以形成连续的线性结构，进而使得在硝酸纤维素膜的制造中很难实现均匀性，且硝酸纤维素膜机械性能较差，膜非常脆且容易断裂。使用扫描型电子显微镜上观察市售多孔硝酸纤维素蛋白印迹膜的代表性样品表面，其开孔多为不规则的形态，截面也呈现出不连续的线性结构，整体的机械性能较弱。

5、目前市面上大部分针对于硝酸纤维素膜的改进都是侧重于改善其亲水性，比如中国专利cn114130373b提供了一种硝酸纤维素膜是引入水滑石，将功能性高分子材料嵌入到水滑石中以提高硝酸纤维素膜的亲水性，但是未能解决硝酸纤维素膜的机械性能的问题；中国专利cn112094424b提供了一种硝酸纤维素层析膜的制备方法，也是通过引入醋酸纤维素和亲水性聚合物来改善硝酸纤维素膜的亲水性，从其提供的附图中也可以看到其生成的硝酸纤维素膜的开孔多为不规则形态且呈现出不连续的线性结构，这就导致这种硝酸纤维素膜的机械性能较差。

6、鉴于以上问题，亟需开发一种机械性能良好、能更有效地用于蛋白印迹测定的硝酸纤维素膜。

技术实现思路

1、本发明的目的在于一种硝酸纤维素蛋白印迹膜及其制备方法和应用，制备得到的硝酸纤维素蛋白印迹膜具有良好的力学性能和蛋白吸附能力，特别适用于蛋白印迹测定及分析。

2、为实现以上目的，本技术方案提供了一种硝酸纤维素蛋白印迹膜的制备方法，包括：

3、(1)制备硝酸纤维素铸膜液：

4、将设定质量比例的硝酸纤维素、非溶剂以及溶剂混溶制备得到混合溶液，在混合溶液中添加质量浓度为0.2～2％的金属盐并搅拌均匀后得到硝酸纤维素铸膜液，其中金属盐中的金属离子对应元素周期表中ai-aiii、bi-biii且离子半径小于1.33a的金属；

5、(2)制备硝酸纤维素蛋白印迹膜：

6、将硝酸纤维素铸膜液涂覆成膜，并在设定的成膜条件下置于成膜空间内进行相转化得到硝酸纤维素蛋白印迹膜。

7、本领域技术人员能够知晓的是，多孔硝酸纤维素膜的机械性能受多种因素的影响，如膜的孔隙率、孔径大小、开孔形状、分子链形态等，通常认为多孔硝酸纤维素膜的孔隙率越大以及孔径越大，则对应的多孔硝酸纤维素膜的机械性能也越弱，反之亦然；故相对规则的圆形开孔形态会比不规则开孔形态具备更好的机械性能，同时分子链呈现出支状结构会比线性结构的机械性能也更为有优势。而本方案提供的硝酸纤维素蛋白印迹膜的制备方法在铸膜液中加入元素周期表中ai-aiii、bi-biii且离子半径小于1.33a的金属盐，以使得硝酸纤维素蛋白印迹膜在蒸发成型后会从内部到外部发生微相分离，通过微相分离的方式使单相溶液引起凝胶，进而使得硝酸纤维素蛋白印迹膜内构造更为规则的圆孔形态，使膜具备良好的机械性能。

8、本方案中的元素周期表内的a族元素是主族元素，b族元素是过渡族元素，“ai-aiii”指的是周期表中a族元素的某个连续区间，“bi-biii”指的是周期表中b族元素的某个连续区间。在一些实施例中，金属盐中的金属离子为锂(离子半径：0.60a)、钠(离子半径：0.95a)、钾(离子半径：1.33a)、镁(离子半径：0.65a)、钙(离子半径：0.99a)、铝(离子半径：0.50a)、铜(离子半径：0.96a)、锌(离子半径：0.74a)、银(离子半径：1.26a)的一种或以上组合。

9、另外，金属盐中同金属离子进行偶联的离子为负离子中的任一种。在一些实施例中，金属盐中同金属离子进行偶联的离子为卤素离子或者高氯酸根离子。特别的，金属盐可以是cacl2、licl等。

10、在一些实施例中，将质量分数为8～11％的硝酸纤维素、质量分数为10～40％的非溶剂、质量浓度为40～60％的溶剂混溶制备成混合溶液。

11、在一些实施例中，本方案的硝酸纤维素优选为高度纯化的硝酸纤维素，硝酸纤维素的硝化程度为8％～12％，优选的，硝酸纤维素的硝化程度为11％～12％。在一些实施例中，硝酸纤维素的粘度为20～40cps，优选的，硝酸纤维素的粘度为31～34cps。硝酸纤维素的粘度在乙醇、乙酸甲酯组合溶剂中通过标准方法测定。本方案之所以选择高纯化以及特定粘度的硝酸纤维素是为了提高硝酸纤维素蛋白印迹膜的均匀性和稳定性，使其具有良好的耐化学性和稳定性。

12、在一些实施例中，本方案的溶剂选择为丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯或二氯甲烷的一种或以上组合，非溶剂选择为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇的一种或以上组合。另外，由于本方案的非溶剂选择为醇类物质，故本方案选择可与醇类物质互溶的金属盐，以在硝酸纤维素蛋白印迹膜中形成规则的圆形开孔形态。

13、在一些实施例中，使用自动涂膜机将得到的硝酸纤维素铸膜液在300～700μm的刮刀间隙下涂覆成膜，随后置于充满恒温恒湿空气的成膜空间，通过一定的成膜条件进行相转化。具体的，在设定的成膜条件下置于成膜空间内进行相转化得到硝酸纤维素蛋白转印膜，用纯净水清洗硝酸纤维素蛋白转印膜后去除金属盐后得到硝酸纤维素蛋白印迹膜。

14、本方案可通过可控的成膜条件来控制硝酸纤维素铸膜液的相转化过程，其中成膜条件包括成膜温度、成膜湿度和成膜时间。在一些实施例中，本方案控制成膜温度在15～30℃范围内，成膜湿度控制在60～95％rh范围内，成膜时间控制在2～4h。纯净水清洗滤膜时间控制在10～15min。

15、需要说明的是，本方案通过金属盐和非溶剂的溶解度以及溶剂的相分离特性选择金属盐的种类。具体的，可采用如图1所示的三角坐标图来建立必要的溶剂百分比条件，以通过微相分离的方式使单相溶液引起凝胶形成条件。更具体地说，图1表示cacl2/丙酮/甲醇的三组分体系的三角形坐标，展示了其相分离特性。在该图中，“a”表示两相分离区域，“b”是微相分离区，“c”是均相区。在图1中，如果假设没有盐析现象，则区域“a”和“b”之间的边界以及区域“b”和“c”之间的边界应指向cacl2的100％点。但在实践中情况并非如此，它们分别指向近60％和40％的点，这表明随着金属盐添加量的增加，凝胶沉淀也相应加快。

16、在本发明的实验过程中，要加入到非溶剂(主要为醇类物质)溶液中的金属盐的量根据其在非溶剂的溶解度以及相对于主溶剂的相分离特性来选择，以便在浇注成膜步骤之前和期间，使成膜的铸膜液保持其均匀相，而在其制备阶段通过蒸发除去溶剂，导致微相分离的出现。

17、第二方面，本方案提供了一种硝酸纤维素蛋白印迹膜，采用所述的硝酸纤维素蛋白印迹膜的制备方法制备得到，该硝酸纤维素蛋白印迹膜的开孔呈现圆形或基本圆形开口结构。

18、第三方面，本方案提供了一种硝酸纤维素蛋白印迹膜的应用方法，将第二方面提到的硝酸纤维素蛋白印迹膜应用于蛋白印迹测定及分析场景。

19、相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：

20、本方案在硝酸纤维素蛋白印迹膜的制备方法中引入金属盐，通过金属盐的引入使得硝酸纤维素蛋白印迹膜在蒸发成型后会从内部到外部发生微相分离，通过微相分离的方式使单相溶液引起凝胶，蒸发以除去溶剂以形成多孔薄膜，最后除去金属盐得到硝酸纤维素转印膜，通过金属盐离子的引入构造更为规则的圆孔形态以使硝酸纤维素蛋白印迹膜具备良好的机械性能。本方案改变了常规硝酸纤维素蛋白印迹膜的开孔形态，使其由原来不规则开孔转变为相对规则的圆形开孔，提升了硝酸纤维素蛋白印迹膜的机械性能，整个过程中原料容易获取，制备过程中的操作简单、步骤简洁，利于实现工业化放大生产，且该方法对设备要求简单。