一种筛选高产黏的唾液链球菌嗜热亚种的方法与流程

本发明涉及微生物和食品生物，具体涉及一种筛选高产黏的唾液链球菌嗜热亚种的方法。

背景技术：

1、酸奶是以牛奶或羊奶为原料，经杀菌、发酵剂菌株发酵后获得的一种结构中含有蛋白质、多糖和脂质的复杂凝胶体系，目前已成为我国第一大发酵乳制品。2017年中国酸奶发酵剂行业市场规模10.2亿元，2022年21.4亿元，预计2029年达到50.3亿。酸奶对人体肠道健康有益外，还具有缓解乳糖消化不良症状和缩短轮状病毒引起的腹泻，增强免疫力等功能等。

2、唾液链球菌嗜热亚种和保加利亚乳杆菌通常被称为“酸奶发酵剂”，共同发酵牛奶后形成酸奶，发酵剂可赋予发酵乳高黏度、快速产酸、丰富的活性物质，因其较高的经济价值而受到广泛关注。乳酸菌的产黏能力是选择发酵剂的主要指标，产黏菌株可以在不影响感官属性的情况下改善酸奶体系的质构、风味和口感，提高食品的品质，延长食品的货架期，已被公认为是发酵乳制品中产生理想风味和质地的关键成分，且作用效果更显著、更安全。

3、目前的方法只能筛选产黏的乳酸菌，对唾液链球菌嗜热亚种最传统的方法是在选择性琼脂平板上检查细菌菌落的拉丝状态（菌落状态和拉丝长度），具有较低的检出限和不敏感性；通过培养基的黏度、分光光度法或重量法定量纯化eps等筛选方法，无法实现高通量筛选的目的。

技术实现思路

1、针对现在缺乏基于多糖生物合成蛋白epsc和墨汁染色法筛选高产黏的唾液链球菌嗜热亚种，本发明提出了一种在发酵乳中多糖生物合成蛋白epsc和墨汁染色法筛选高产黏的唾液链球菌嗜热亚种的方法，该方法可以定向筛选发酵乳中具有高产黏能力的唾液链球菌嗜热亚种，具备高效和特异性筛选的特点，在发酵乳的制备中具有很重要的应用价值。

2、为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

3、本发明第一方面提供多糖生物合成蛋白epsc或其编码基因在鉴定唾液链球菌嗜热亚种产黏功能中的应用；epsc蛋白编码基因包含seq id no:1所示的序列：

4、acatatacatcaacaacgcgtatctatgtggttaatcaggcaacagataataagaatctttctgctgaagctttgcaggccggtacatttttgacaaaagactacaaagaaattattacattaaacgatgtcttgtcagaagttatcaaagatgaaaaattgaatatgacagtagcagaacttgctaaaatgattttagttgataatcctactgatactcgtcttatttcaatttctgttaatgctaaaactggtcaagatgcgcaaacacttgccaataaggttcgtgaagttgcttcagaaaaaatcaagaacgtgacaaaagttgaagatgttacaacgctcgaagaagctaaattgccagagtcaccatcttcaccaaatatcaaacttaatgtgcttcttggggcagtgcttggaggattccttgcagtggttggtgtattggtacgtgaaatcctagatgatcgtgttcgccgtccagaagatgtggaagatgcccttggaatgacacttcttggaattgtccctgatacagataaaatttaa。

5、进一步的，所述的鉴定还包括对epsc表达阳性的菌株进行墨汁染色的步骤；优选的，所述的墨汁染色的操作为：

6、1）按照1~3%（ v/v）的接种量将唾液链球菌嗜热亚种接种至m17-乳糖液体培养基，在42 ± 1℃下培养12h，进行菌株的活化；

7、2）取100μl涂于载玻片上；

8、3）在样本涂片处滴加荚膜染色液；

9、4）加盖盖玻片，并防止气泡产生，用手指轻轻压一下，使样本与荚膜染色液混合变薄，在油镜下观察唾液链球菌嗜热亚种的荚膜。

10、本发明的第二个方面是提供特异性检测epsc表达的试剂在鉴定唾液链球菌嗜热亚种产黏功能中的应用；所述的鉴定还包括对epsc表达阳性的菌株进行墨汁染色的步骤。

11、进一步的，所述的特异性检测多糖生物合成蛋白epsc表达的试剂选自但不限于抗体、探针、引物对；优选的，所述的特异性检测多糖生物合成蛋白epsc表达的试剂为引物对，更优选的，所述的引物对为：

12、epsc-f 5′-cgcgtatctatgtggttaatcag-3’ （seq id no:2）

13、epsc-r 5′-aagtgtcattccaagggcatc-3′ （seq id no:3）。

14、进一步的，所述的鉴定还包括对epsc表达阳性的菌株进行墨汁染色的步骤；优选的，所述的墨汁染色的操作为：

15、1）按照1~3%（ v/v）的接种量将唾液链球菌嗜热亚种接种至m17-乳糖液体培养基，在42 ± 1℃下培养12h，进行菌株的活化；

16、2）取100μl涂于载玻片上；

17、3）在样本涂片处滴加荚膜染色液；

18、4）加盖盖玻片，并防止气泡产生，用手指轻轻压一下，使样本与荚膜染色液混合变薄，在油镜下观察唾液链球菌嗜热亚种的荚膜。

19、本发明的第三个方面是提供一种筛选高产黏的唾液链球菌嗜热亚种的方法，所述的方法包括如下步骤：

20、1）唾液链球菌嗜热亚种的活化培养：按照1~3%（ v/v）接种量将唾液链球菌嗜热亚种于m17-乳糖液体培养基，42 ± 1℃下培养；

21、2）当od600 = 0.8~1.0时，收集菌体，提取菌株dna；

22、3）检测菌株dna中 epsc基因的表达情况；

23、4）对步骤3） epsc基因阳性的菌株进行菌体墨汁染色；

24、5）选择 epsc基因阳性、且菌体周围存在透明晕圈的菌株作为高产黏菌株。

25、进一步地，步骤3）中，所述的检测菌株dna中 epsc基因表达情况的方法为pcr检测；

26、优选的，所述的pcr以

27、epsc-f 5′-cgcgtatctatgtggttaatcag-3’（seq id no:2）和

28、epsc-r5′-aagtgtcattccaagggcatc-3′（seq id no:3）为引物。

29、更优选的，选择ex taq hs建立25 μl体系，pcr条件为：

30、95 ℃，5 min；

31、[95 ℃，30 s；57 ℃，30 s；72 ℃，1 min] × 30个循环；

32、72℃，1 min；4 ℃~，扩增 epsc基因序列。

33、进一步的，步骤4）中，所述的墨汁染色方法为：

34、1）按照1~3%（ v/v）的接种量将唾液链球菌嗜热亚种接种至m17-乳糖液体培养基，在42 ± 1℃下培养12h，进行菌株的活化；

35、2）取100μl涂于载玻片上；

36、3）在样本涂片处滴加荚膜染色液；

37、4）加盖盖玻片，并防止气泡产生，用手指轻轻压一下，使样本与荚膜染色液混合变薄，在油镜下观察唾液链球菌嗜热亚种的荚膜。

38、本发明相比现有技术的有益效果为：

39、（1）依据本发明筛选发酵乳中高产黏的唾液链球菌嗜热亚种，发明通过多糖生物合成蛋白epsc和墨汁染色法比较，确定唾液链球菌嗜热亚种是否具有 epsc基因，以及菌株表面是否有荚膜，可以筛选高产黏唾液链球菌嗜热亚种。

40、（2）据本发明筛选发酵乳中高产黏的唾液链球菌嗜热亚种，发明通过多糖生物合成蛋白epsc和墨汁染色法，使唾液链球菌嗜热亚种在乳基中发酵，6小时后发酵乳的黏度显著大于不产黏的菌株。

41、（3）与传统筛选方法比较，本发明通过多糖生物合成蛋白epsc和墨汁染色法快速筛选高产黏的唾液链球菌嗜热亚种，本发明具有高效和特异性筛选的特点，避免传统筛选方法中单一性和非特异性筛选的缺陷。