一种用于制备转铁蛋白的工程菌及其应用的制作方法

本技术涉及基因工程，尤其涉及用于制备转铁蛋白的工程菌及其应用。

背景技术：

1、转铁蛋白是血液中主要的铁结合糖蛋白和细胞间的铁传递分子，参与铁从吸收或储存部位向不同组织细胞的转运过程，特别是将铁转运至红细胞和外周组织中。转铁蛋白具有广泛的生物学活性，可用作毒性金属离子的螯合剂，能够清除溶液中有害的多价阳离子，起到解毒作用。也是一种重要的胞外抗氧化剂，可以避免细胞外环境中自由基的产生，防止细胞受到伤害。是无血清或低血清细胞培养系统中大多数细胞系必须的一种添加剂，已被用于多种培养基，例如分化培养基、血液内皮细胞培养基、角质形成细胞培养基、胚状体培养基等。转铁蛋白还具有防止贫血、缓解类风湿关节炎和抗衰老等生理功能，被广泛应用于食品、药品、化妆品和医药领域中，因此转铁蛋白已经成为国际上竞相研发的生物制品（谢俊,黄英.重组转铁蛋白的研究进展[j].中国医药生物技术,2010,5(06):451-454.）。

2、转铁蛋白的获取主要来自献血者的血浆之中，由于血源供应困难且有感染病毒的风险，限制了通过血浆大量获得转铁蛋白的可能。目前研究者已经利用大肠杆菌、酵母、动物细胞等表达了重组人转铁蛋白。agc株式会社（cn109153985a）将粟酒裂殖酵母作为宿主，构建了含有转铁蛋白基因的转化体，在5 l的培养规模下，经96 h诱导后，转铁蛋白的分泌量为0.43 g/l。诺维信生物制药丹麦公司（cn101842110a）通过将转铁蛋白序列突变，控制糖基化，重组转铁蛋白（s32a，s415a，t613a）突变菌株的高细胞密度发酵产量可达2.26 g/l。诺维信达尔塔有限公司（cn101128587a）通过共表达二硫键异构酶pdi，并使用融合前导物作为信号肽，经高细胞密度发酵，重组非糖基化转铁蛋白（n413q、n611q）的表达量约为3.5 g/l。vtu技术有限责任公司（cn103906833a）使用cbs7435突变体pdi平台生成的转铁蛋白菌株，在1 l生物反应器中，90 h的甲醇诱导后，转铁蛋白的产量可达5.4 g/l。

3、酵母表达系统虽然具有生长快，操作简单的特点。但是当外源蛋白高水平表达时，易产生蛋白质的错误折叠和积累甚至产生沉淀。分子伴侣是一类对蛋白质翻译、转运、折叠和修饰均具有重要作用的蛋白质分子，广泛存在于细胞质、内质网等亚细胞结构中。

4、细胞内分子伴侣ssa1/ydj1/hsp104能够共同作用，从而防止蛋白质前体的聚集，并使已发生的蛋白质多聚体解聚（杜济良.分子伴侣与信号肽对分泌蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响研究[d].中国人民解放军军事医学科学院,2011.）。ssa1蛋白是热休克蛋白70家族的重要成员，主要分布在酵母细胞中以分子伴侣形式发挥作用，它能够帮助新合成蛋白质正确折叠，修复错误折叠，并解折叠聚集蛋白复合体，而且还具有调节蛋白的活性，进行细胞器和分泌蛋白的跨膜易位等功能（张桥石.ssa1蛋白nbd结构域点突变对atpase循环的分子动力学研究[d].辽宁大学,2016.）。ydj1蛋白是热休克蛋白40家族成员，作为辅助分子伴侣能够调节ssa1蛋白的atp酶活性和多肽链结合活性，催化结合底物从ssa1p上释放。可以帮助新生肽形成正确的利于进入内质网的中间体形态。hsp104是一个六聚环状的atp酶，分子伴侣蛋白具有结合并改变非天然多肽蛋白构象的能力,它能通过挤压蛋白的方式使蛋白通过中央腔，从而使聚集体溶解（周小红.酵母ssa1氮端结构域结构与功能的分子动力学模拟研究[d].辽宁大学,2014.）。

5、内质网是蛋白质合成和成熟的必要场所，包含着许多分子伴侣，参与到翻译后修饰、二硫键形成、折叠、组装等过程中。其中钙连蛋白（cne1）是内质网膜上的凝集素样分子伴侣蛋白，帮助蛋白质新生肽链的折叠，参与蛋白质加工、组装等过程。kar2内质网腔分子伴侣，可与未折叠蛋白的疏水区结合，防止蛋白质间相互聚集同时又协助蛋白质折叠。蛋白质翻译后需通过sec61通道运输到内质网中，sec63与sec62以分层方式协同工作激活sec61以进行翻译后蛋白质易位（itskanov s. stepwise gating of the sec61 protein-conducting channel by sec63 and sec62. nat struct mol biol 28, 162–172(2021).）。其中sec63可招募hsp70家族bip/grp78/kar2参与蛋白易位（feldheim d.topology and functional domains of sec63p, an endoplasmic reticulum membraneprotein required for secretory protein translocation. mol. cell biol. 12,3288–3296 (1992).）。

技术实现思路

1、本发明中通过研究细胞内和内质网分子伴侣共表达，并结合基因拷贝数，以毕赤酵母作为表达宿主，实现转铁蛋白的高效表达，为转铁蛋白的产业化应用奠定基础。

2、本发明的目的是提供一种高效表达转铁蛋白的工程菌及其应用，通过结合高拷贝、不同分子伴侣共表达获得的重组人转铁蛋白毕赤酵母菌株，经高密度发酵实现了高效表达，最终产量可达10 g/l。

3、一方面，本技术提供了一种制备转铁蛋白的工程菌，所述工程菌表达分子伴侣和转铁蛋白；

4、所述转铁蛋白为脱糖人血转铁蛋白；所述转铁蛋白为脱糖人血转铁蛋白突变体，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基、和/或第415位丝氨酸残基突变为缬氨酸残基、和/或第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基、和/或第613位苏氨酸残基突变为亮氨酸残基获得，所述野生型人血转铁蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、本领域技术人员可以理解的是，本技术中蛋白质编码规则遵循常用规则，以第413位为例，所述第413位突变即指自参比序列n端开始向c端方向顺序计数第413个氨基酸位点。

6、优选的，编码所述野生型人血转铁蛋白的核苷酸序列如seq id no.2 或与seq idno.2至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。

7、优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第415位丝氨酸残基突变为缬氨酸残基和第613位苏氨酸残基突变为亮氨酸残基获得，所述脱糖人血转铁蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，编码所述脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列如seq id no.4或与seq id no.4至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。

8、优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基和第613位苏氨酸残基突变为亮氨酸残基获得，所述脱糖人血转铁蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.5所示，编码所述脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列如seq id no.6或与seq id no.6至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。

9、优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第415位丝氨酸残基突变为缬氨酸残基和第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基获得，所述脱糖人血转铁蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示，编码所述脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列如seq id no.8或与seq id no.8至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。

10、优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基和第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基获得，所述脱糖人血转铁蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.9所示，编码所述脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列如seq id no.10或与seq id no.10至少具有98％同一性的核苷酸序列所示。

11、进一步地，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基和第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基获得。

12、优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体的氨基酸序列如seq id no.9所示，所述编码脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列如seq id no.10所示。

13、进一步地，所述分子伴侣包括细胞内分子伴侣和/或内质网分子伴侣；所述细胞内分子伴侣选自ssa1、ydj1、hsp104中的一种或多种；所述内质网分子伴侣选自cne1、kar2、sec63中的一种或多种。

14、优选的，所述分子伴侣包括1种细胞内分子伴侣和2种内质网分子伴侣。

15、在一种优选的实施方式中，所述的细胞内分子伴侣ssa1的氨基酸序列如seq idno.11所示，核苷酸序列如seq id no.12所示；

16、所述的细胞内分子伴侣ydj1的氨基酸序列如seq id no.13所示，核苷酸序列如seq id no.14所示；

17、所述的细胞内分子伴侣hsp104的氨基酸序列如seq id no.15所示，核苷酸序列如seq id no.16所示；

18、所述的内质网分子伴侣cne1的氨基酸序列如seq id no.17所示，核苷酸序列如seq id no.18所示；

19、所述的内质网分子伴侣kar2的氨基酸序列如seq id no.19所示，核苷酸序列如seq id no.20所示；

20、所述的内质网分子伴侣sec63的氨基酸序列如seq id no.21所示，核苷酸序列如seq id no.22所示。

21、进一步地，所述分子伴侣包括细胞内分子伴侣和内质网分子伴侣，所述细胞内分子伴侣为hsp104，所述内质网分子伴侣为cne1和sec63。

22、进一步地，所述工程菌中至少包含1个拷贝的编码转铁蛋白的核苷酸序列。

23、优选的，所述工程菌中编码转铁蛋白的核苷酸序列拷贝数为2-3。

24、进一步地，所述工程菌中还包括酿酒酵母a交配因子信号肽；优选的，编码所述酿酒酵母a交配因子信号肽的核苷酸序列如seq id no.23所示。

25、进一步地，

26、所述工程菌选自毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母、酿酒酵母中的一种或多种。

27、优选的，所述工程菌为毕赤酵母；更优选的，所述毕赤酵母为毕赤酵母cbs7435。

28、另一方面，本技术还提供了用于提高转铁蛋白表达量的分子伴侣，所述分子伴侣包括细胞内分子伴侣和/或内质网分子伴侣；所述细胞内分子伴侣选自ssa1、ydj1、hsp104中的一种或多种；所述内质网分子伴侣选自cne1、kar2、sec63中的一种或多种。

29、优选的，所述分子伴侣包括细胞内分子伴侣和内质网分子伴侣，所述细胞内分子伴侣为hsp104，所述内质网分子伴侣为cne1和sec63。

30、另一方面，本技术还提供了生物材料，所述生物材料包括如下a1）-a3）任一种：

31、a1）核酸分子，所述核酸分子含有编码所述分子伴侣和/或脱糖人血转铁蛋白突变体的核酸分子；所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基、和/或第415位丝氨酸残基突变为缬氨酸残基、和/或第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基、和/或第613位苏氨酸残基突变为亮氨酸残基获得，所述野生型人血转铁蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；

32、a2）表达盒，所述表达盒含有a1）所述核酸分子；优选的，所述表达盒包括启动子和终止子；更优选的，细胞内分子伴侣采用组成型启动子，内质网分子伴侣采用诱导型启动子；

33、a3）重组载体，所述重组载体含有a1）所述核酸分子和/或a2）所述表达盒。

34、本文所述表达盒中还可包含启动子、终止子、标记基因等功能性元件，本领域技术人员可根据实际情况进行常规选择，只要能够完成a1）所述核酸分子的表达即可，此处不再对表达盒的结构及组成进行过多限制。在一种优选的实施方式中，所述组成型启动子为gap，诱导型启动子为aox1。

35、在一种优选的实施方式中，一种表达脱糖人血转铁蛋白突变体的表达盒，所述表达盒中包括编码酿酒酵母a交配因子信号肽的核苷酸序列、编码脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列。

36、在一种优选的实施方式中，一种表达脱糖人血转铁蛋白突变体的表达盒，所述表达盒中包括aox1启动子、编码酿酒酵母a交配因子信号肽的核苷酸序列、编码脱糖人血转铁蛋白突变体的核苷酸序列、aox1末端终止子。

37、本文所述载体是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）或病毒载体。在一种优选的实施方式中，重组载体可为ppicza。

38、可以理解的是，本领域技术人员可以根据实际情况选择适合的基因编辑系统和基因编辑方法完成所述突变改造。另外，在不影响所述生物材料正常功能的前提下，本领域技术人员也可以根据实际情况对上述生物材料进行修饰或利用已知的筛选标记进行筛选。

39、在一种优选的实施方式中，所述筛选基因可为遗传霉素geneticin基因和/或杀稻瘟菌素blasticidin基因。编码所述遗传霉素的核苷酸序列如seq id no.24所示，编码所述杀稻瘟菌素的核苷酸序列如seq id no.25所示。

40、另一方面，本技术还提供了所述工程菌或所述分子伴侣或所述生物材料在制备转铁蛋白和/或提高转铁蛋白表达量中的应用。

41、优选的，所述转铁蛋白为脱糖人血转铁蛋白突变体。

42、更优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基和第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基获得。

43、另一方面，本技术还提供了一种制备转铁蛋白的方法，所述方法包括：采用所述的工程菌发酵制备转铁蛋白。

44、优选的，所述转铁蛋白为脱糖人血转铁蛋白突变体。

45、更优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基和第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基获得。

46、在一种优选的实施方式中，所述方法包括：取工程菌接种于培养液中100-300 rpm25℃-41℃培养12-24 h，取菌液离心重悬，100-300 rpm 25℃-41℃开始诱导，每12-24 h加入0.1%-0.5%甲醇，72 h后10000 rpm离心5 min，收集上清。

47、本技术工程菌可采用转铁蛋白通用制备方式进行发酵和扩大生产。

48、另一方面，本技术还提供了一种所述方法制备的转铁蛋白突变体，所述转铁蛋白突变体为脱糖人血转铁蛋白突变体，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基、和/或第415位丝氨酸残基突变为缬氨酸残基、和/或第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基、和/或第613位苏氨酸残基突变为亮氨酸残基获得，所述野生型人血转铁蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

49、优选的，所述脱糖人血转铁蛋白突变体由野生型人血转铁蛋白的第413位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基和第611位天冬酰胺残基突变为谷氨酸残基获得。

50、本发明具有如下有益效果：

51、本发明提供了一种转铁蛋白突变体（即重组转铁蛋白），具体的，将人血转铁蛋白第413位、第415位、第611位、第613位进行至少一个突变后能够获得高表达量的脱糖人血转铁蛋白突变体，为转铁蛋白提供了新的突变有益突变位点和突变方法，并获得了一种新的高效生产突变体。

52、本发明中通过发酵实验发现，当共表达1种细胞内分子伴侣和2种内质网中分子伴侣时，能够加强重组转铁蛋白的表达分泌能力。

53、本发明为转铁蛋白的工业化生产提供了一种新的高效表达人血转铁蛋白的毕赤酵母，经高密度发酵能够实现高效表达，最终产量可达10 g/l，大大提高了转铁蛋白的生产效率，为工业化生产重组人转铁蛋白提供了一种实际有效的策略。